枯草芽孢桿菌高產中性蛋白酶發酵條件的優化

劉 穎，張彬彬，孫冰玉，劉琳琳，鄒麗宏，石彥國*

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

枯草芽孢桿菌高產中性蛋白酶發酵條件的優化

劉 穎，張彬彬，孫冰玉，劉琳琳，鄒麗宏，石彥國*

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

通過單因素試驗和正交試驗對枯草芽孢桿菌10075菌株發酵產中性蛋白酶的培養基組分及培養條件進行優化，達到提高菌株中性蛋白酶產量的目的。結果表明，發酵培養基的最佳組分：添加麥芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO40.08%；最適發酵條件為發酵溫度37 ℃、初始pH 7.0、發酵時間42 h，酶活力由最初的98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。

枯草芽孢桿菌；中性蛋白酶活力；發酵；優化

中性蛋白酶是最早發現并應用于生產的工業酶制劑，現已廣泛應用于皮革、毛皮、絲綢、醫藥、食品、釀造等方面[1-9]，在醫藥和食品工業中尤為突出。但中性蛋白酶的產量低、成本高等因素限制其大規模生產[10-11]。因此，對該酶類生產技術的研究受到廣泛關注。微生物蛋白酶，主要由霉菌[12-14]、細菌，其次由酵母、放線菌生產。枯草芽孢桿菌是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[15]，是當今工業酶的主要生產菌種之一，是工業生產上應用最廣泛的菌種之一。目前，由枯草芽孢桿菌生產的酶制劑占整個酶制劑市場的50%，主要用于生產淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[16-17]。枯草芽孢桿菌酶主要應用領域是食品工業，全世界的食品工業用酶量約占生產總量的60%，在我國則高達85%以上[18]。

本實驗以中性蛋白酶活力為主要的考察指標，對枯草芽孢桿菌 10075的產蛋白酶情況進行研究，以碳源、氮源和無機鹽種類，碳、氮源添加量、培養基初始pH值、發酵溫度、發酵時間為考察條件，通過單因素試驗和正交試驗，確定菌株產中性蛋白酶的最優發酵培養基和培養條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

枯草芽孢桿菌10075 工業菌種保藏中心。

種子培養基：氯化鈉5.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L，pH 7.2，121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min；基礎發酵培養基：葡萄糖2.0 g/100 mL、牛肉粉2.0 g/100 mL，pH 7.2，121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

干酪素、營養瓊脂、蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉北京雙旋微生物培養基制品廠；氯化鈉、氯化鈣（分析純） 西隴化工股份有限公司；福林酚試劑 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

單人潔凈工作臺 北京東聯哈爾濱儀器制造有限公司；722型分光光度計 上海儀分科學儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計 南京互川電子有限公司；XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫療器械有限公司；DKZ電熱恒溫振蕩水槽、電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；80-2離心機 上海浦東光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌初始發酵條件

將活化好的斜面菌株接種在種子培養基中（100 mL/25 0 mL），30 ℃、200 r/min振蕩培養24 h，使孢子濃度達到108個/mL，菌懸液以2.0%的接種量接入發酵培養基（100 mL/250 mL），30 ℃、pH 7.0、150 r/min培養48 h，以中性蛋白酶酶活力作為評價指標。

1.3.2 中性蛋白酶酶活力測定

按照國家標準GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》，采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力[19]。

1.3.3 中性蛋白酶發酵培養基優化

采用單因素試驗，分別考察碳源種類及其添加量、氮源種類及其添加量和無機鹽對產中性蛋白酶的影響。

以2.0%的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源，2.0%牛肉粉為氮源進行發酵，確定發酵培養基最佳碳源。

1.3.3.2 氮源種類的影響

以2.0%麥芽糖為碳源，以2.0%的牛肉粉、蛋白胨、酵母浸粉、大豆粉、NH4Cl為氮源進行發酵，確定發酵培養基最佳氮源。

1.3.3.3 碳源添加量對菌種產中性蛋白酶的影響

以2.0%蛋白胨為氮源，以不同麥芽糖添加量2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%進行發酵，確定發酵培養基最優碳源添加量。

1.3.3.4 氮源添加量對菌種產中性蛋白酶的影響

以8.0%麥芽糖為碳源，以不同蛋白胨添加量2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%進行發酵，確定發酵培養基最優氮源添加量。

1.3.3.5 無機鹽對菌種產中性蛋白酶的影響

以8.0%麥芽糖和8.0%蛋白胨為碳氮源，并添加0.04%的KH2PO4、CaCl2、MgSO4、NaCl、FeSO4進行發酵，確定培養基最優無機鹽。

水利現代化規劃是水利現代化建設綱領性文件和頂層設計，內容既包括防洪減災、水資源供給、水生態保護、城市水利、農村水利等功能體系建設安排，也包括水利社會管理與公共服務能力、水利發展保障能力等保障體系建設安排，是水利全面發展的規劃安排，具有明顯的發展規劃特征。同時水利現代化規劃要根據區域自然條件、水利發展狀況和經濟社會發展戰略布局，研究本區水利發展戰略和發展模式，提出具有地區特點和階段特征的水利現代化建設總體目標與布局，對較長時期的水利建設和管理具有指導作用，具有一定的戰略性。因此，水利現代化規劃可定位為具有戰略性的水利發展規劃。

1.3.4 枯草芽孢桿菌發酵培養基正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，確定碳源、氮源、無機鹽這3 個因素對菌株10075產蛋白酶活力具有顯著性影響（P＜0.05），選取L9（34）正交表進行優化試驗，以中性蛋白酶酶活力為評價指標，進行枯草芽孢桿菌發酵培養基組分的優化。

1.3.5 菌株10075產中性蛋白酶培養條件優化

利用優化后的培養基，采用單因素試驗對培養條件進行優化，分別考察時間、溫度、初始pH值對產中性蛋白酶的影響。

2 結果與分析

圖1 碳源種類對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.1 碳源種類對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響由圖1可知，菌株10075在麥芽糖（P＜0.05）作為碳源時酶活力最高，為155.05 U/mL，乳糖次之，菌株10075對這兩種碳源的利用效果較好，這可能與菌體蛋白酶系的合成有關。而葡萄糖作為碳源時，菌株酶活力最低為98.36 U/mL，可能是葡萄糖對產酶有阻遏或誘導作用。結果說明二糖比單糖更能促進菌體產酶，因而選擇麥芽糖作為碳源。

2.2 氮源種類對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響

圖2 氮源種類對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

在微生物的代謝過程中，氮源主要被轉化為核酸、氨基酸以及構成細胞壁的成分，并且是微生物生長的主要營養。由圖2可知，蛋白胨（P＜0.05）作為氮源時菌株10075的酶活力最高，為165.05 U/mL。當選用NH4Cl作為無機氮源時，菌株不產酶，說明NH4Cl不利于產生中性蛋白酶。

2.3 麥芽糖添加量對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響碳源是細菌發酵中所需最多的營養物質，麥芽糖添加量直接影響菌種的產酶情況。由圖3可知，當麥芽糖添加量為培養基總質量的2.0%～8.0%時，菌株10075的蛋白酶活力顯著上升（P＜0.05），達到8.0%時對麥芽糖的利用效果最好，產生的酶活力最高，達到195.06 U/mL，隨著麥芽糖添加量的降低，酶活力有較顯著下降。

圖3 麥芽糖添加量對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.3 Effect of maltose concentration on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.4 蛋白胨添加量對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響

圖4 蛋白胨添加量對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.4 Effect of peptone concentration on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

酶本身是蛋白質，而氮元素是構成蛋白質的主要元素，因此氮源添加量對于產酶有重要作用。實驗測定了不同添加量的蛋白胨對菌株產酶的影響，由圖4可知，當蛋白胨添加量為培養基總質量的2.0%～8.0%時，菌株10075的蛋白酶活力顯著上升（P＜0.05），當蛋白胨添加量為8.0 %時，菌株對氮源的利用效果達到最好，達到243.41 U/mL。而當蛋白胨添加量高于8.0%時，由于添加量過高，會導致溶液變得黏稠，使底物流動性下降，不利于菌株生長及產酶。當蛋白胨的添加量由4.0%增大到8.0%時，會導致生產成本大幅度提高，而蛋白酶活力由218.40 U/mL提到到243.41 U/mL，僅提高了1.1%，綜合考慮實驗結果和生產成本問題，最終選定蛋白胨添加量為4.0%。

2.5 無機鹽對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶活力的影響

由圖5可知，NaCl對菌株10075產酶略有促進作用（P＜0.05），Na+能使細胞膜內外滲透壓改變，膜通透能力增加，而微生物原蛋白水解酶均為胞外酶，膜內外滲透壓的改變有利于酶向膜外運輸，并且NaCl可能對目的菌株具有一定的激活作用，因而產酶效果較好；Mg2+是許多酶的輔助因子，并且參與微生物細胞壁的形成，產酶效果最好，對產酶具有重要作用[20]。二者均對菌株10075產酶均有促進作用，但MgSO4的效果更好（P＜0.05），這時酶活力達到231.74 U/mL，而CaCl2、FeSO4、KH2PO4對產酶有不同程度的抑制作用。

圖5 無機鹽對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.5 Effect of inorganic salts on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.6 正交試驗確定對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶最佳發酵培養基

在單因素試驗基礎上，菌株10075選取對中性蛋白酶活力影響顯著（P＜0.05）的麥芽糖、蛋白胨、MgSO4為考察對象，選用L9（34）分別進行正交試驗，采用SPSS17.0進行分析，結果見表1、2。

表1 菌株10075培養基優化正交試驗結果Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of medium components for Bacillus subtilis 10075

表2 枯草芽孢桿菌10075培養基優化正交試驗結果方差分析Table 2 Analysis of variance for the optimization of medium components for Bacillus subtilis 10075

菌株10075正交試驗極差分析結果由表1可知，對蛋白酶活力影響大小為：麥芽糖＞蛋白胨＞MgSO4，優化的最優產酶條件為A2B2C3，即麥芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO40.08%，在此條件下測得蛋白酶活力為238.40 U/mL，正交表中方案6的條件產酶最高，為231.74 U/mL，因此選取A2B2C3為最優結果，既節省成本又能達到理想的效果。由表2方差分析可知，對蛋白酶活力影響大小為：麥芽糖＞蛋白胨＞MgSO4，麥芽糖和蛋白胨均對中性蛋白酶活力有顯著影響，而MgSO4沒有顯著影響。

圖6 發酵溫度對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.6 Effect of temperature on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.7 發酵溫度對菌株產中性蛋白酶的影響由圖6可知，發酵溫度在26～37 ℃時，菌株產酶活力呈逐步升高的趨勢（P＜0.05），而當培養溫度在37～40 ℃范圍產酶活力下降，由于溫度過高會導致部分酶蛋白變性失活，化學反應速率和代謝減弱，代謝產物減少，最初大量繁殖的細菌會分解代謝產生熱量，使底物濃度更高，促進細菌衰老[21]。菌株10075在37 ℃時達到最適溫度，此時酶活力達到238.40 U/mL。溫度不僅影響各種酶的反應速率和蛋白質性質，還會影響發酵液的物理性質。溫度升高使反應速率和生長代謝加快，提高微生物代謝物產量，但會導致菌體衰老，并縮短了發酵周期，使產酶量減少。

2.8 發酵時間對菌株產中性蛋白酶的影響

圖7 發酵時間對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

發酵時間影響影響菌體的生長情況和蛋白酶產量。由圖7可知，在發酵24 h內，發酵液中產酶量很低，培養時間在24～42 h時，菌株蛋白酶的活力在逐漸的上升（P＜0.05），而當培養時間在42 h時，蛋白酶的活力達到最大值。在之后的延長培養時間，蛋白酶的活力有明顯的（P＜0.05）下降趨勢，因為在發酵后階段，底物不斷消耗的同時，微生物也在逐漸衰亡，導致產酶下降。最佳培養時間確定為42 h，此時菌株10075酶活力達到353.45 U/mL。

2.9 初始pH值對菌株產中性蛋白酶的影響

圖8 初始pH值對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的影響Fig.8 Effect of initial medium pH on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

由于發酵過程中的pH值很難準確控制，所以選擇控制發酵液的初始pH值。由圖8可知，菌株的初始pH值在7.0～8.0范圍內產酶效果較好（P＜0.05），pH 7.0時，菌種10075酶活力最高，為353.45 U/mL。說明中性培養基有利于菌株產酶；酸性培養基不利于菌株產酶。pH值通過影響菌體營養物質離子化程度、細胞膜電荷及膜滲透性，影響菌體對養分的吸收。對于大多數菌種來說，一般具保持其體內的細胞質酸度在近中性條件下的能力，利于新陳代謝和各種酶反應，底物的pH值對細胞的新陳代謝和產酶有間接的影響，在不同的初始pH值條件下菌株的生長繁殖能力和產中性蛋白酶的能力存在著一定的差異。

3 結 論

通過優化培養基條件：碳源種類及添加量、氮源種類及添加量和無機鹽種類的單因素試驗，進一步進行正交試驗，確定菌株10075最優培養基為麥芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO40.08%，培養條件優化結果為pH7.0、發酵時間42 h、發酵溫度37 ℃，通過對發酵條件的優化，酶活力由98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。

本實驗確定了產中性蛋白酶發酵培養基的最佳無機鹽種類，但是對無機鹽添加量的多少并沒有進行單因素試驗，會對結果產生一定影響。并且一些表面活性劑也可能會促進產酶，有待于進一步實驗。芽孢桿菌能夠分泌多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等[22]，產生酶系的種類與產酶量密切相關，因此實驗菌株要應用于工業生產，應對其產生的多種酶進行系統的檢測，明確相互之間的影響，并對生產成本與產品品質進行辨證考慮，才能最終確定最佳的工業發酵條件。利用枯草芽孢桿菌菌株發酵生產蛋白酶，具有發酵周期短、產酶量高、安全性好等優點，同時，枯草芽孢桿菌菌株對紫外線敏感，可利用紫外誘變進行菌種選育，能夠進一步提高其酶的產量[23-24]。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Neutral Protease by Bacillus subtilis 10075

LIU Ying, ZHANG Bin-bin, SUN Bing-yu, LIU Lin-lin, ZOU Li-hong, SHI Yan-guo*
(Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The medium components and culture conditions for Bacillus subtilis 10075 were optimized by single-factor and orthogonal array design methods to increase the production of neutral protease. The results showed that the optimized medium consisted of 8.0% maltose, 4.0% peptone and 0.08% MgSO4, and the optimized culture conditions were 37 ℃, 7.0 and 42 h for temperature, initial pH and time, respectively. The activity of neutral protease after optimization was increased from 98.36 to 353.45 U/mL.

Bacillus subtilis; neutral protease activity; fermentation; optimization

Q939.97；TS201.3

A

1002-6630（2014）13-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201413032

2013-08-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B03）

劉穎（1968—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：154057693@qq.com

*通信作者：石彥國（1960—），男，教授，碩士，研究方向為大豆、谷物化學及加工。E-mail：yanguosh@163.com