桑色素對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用

王亞杰，張國文*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

桑色素對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用

王亞杰，張國文*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

在磷酸鹽緩沖體系（pH 7.5）中，利用紫外光譜法、熒光光譜法和圓二色譜法，結合分子模擬技術研究了桑色素對黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）活性的抑制機理。結果表明：桑色素是一種有效的可逆性混合型抑制劑，其半數抑制濃度（IC50）和抑制常數（Ki）分別為1.35×10–5mol/L和1.21×10–5mol/L；桑色素通過疏水作用力與XO形成基態復合物導致XO內源熒光的猝滅，并誘導XO的二級結構發生改變；分子模擬結果進一步證實桑色素主要通過疏水作用力結合到 XO的活性中心，與Phe914、Phe649、Phe1009、Leu648、Leu1014和Leu873等主要氨基酸發生作用。推測桑色素進入XO的疏水腔，阻礙了底物黃嘌呤進入XO活性中心并影響了XO活性中心的形成，從而抑制了XO對黃嘌呤的催化活性。

桑色素；黃嘌呤氧化酶；抑制動力學；結合性質；光譜技術；分子模擬

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是體內核酸代謝中重要的酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸[1]。當體內XO活性過高，會引起尿酸生成過多，過高的尿酸將導致高尿酸血癥，進而引發痛風[2]。痛風已成為繼糖尿病之后的第二大代謝性疾病，這種疾病已被聯合國列為21世紀 20大頑癥之一[3]。最新的流行病學研究表明，由于生活水平不斷提高、飲食結構的不合理和生活節奏的加快，我國痛風的發病率逐年上升，已高于世界平均水平[3]。由于XO是人體內產生尿酸過程中的一種關鍵性酶，因而將XO作為作用靶點，抑制其活性成為了臨床治療痛風的主要途徑。目前，別嘌呤醇是用于臨床治療痛風的主要藥物，由于會引起過敏、肝腎損傷及骨髓抑制等不良反應，這在一定程度上限制了其臨床應用[4]。因此，研究開發新的XO抑制劑是一項重要的課題。

桑色素（morin）是一種存在于洋蔥、番石榴葉和海藻等植物中的黃酮類化合物[5]，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等生物活性[6-8]。有文獻報道桑色素對XO具有良好的抑制活性[9]，但其與XO的結合性質和抑制機理尚不明確。因此，本實驗利用紫外、熒光和圓二色譜等光譜方法并結合分子模擬技術探測桑色素與XO的結合作用及其抑制XO活性的分子機理，以期為桑色素作為XO抑制劑的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桑色素（分析級，純度≥98%），購于阿拉丁試劑有限公司，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制成濃度為5.0×10－3mol/L的貯備液（含10%二甲基亞砜）。

牛乳黃嘌呤氧化酶（EC 1.17.3.2，酶活力35.7 U/mL，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液現配現用）、黃嘌呤和別嘌呤醇 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；F-7000型熒光光度計 日本日立公司；MOS-450型圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；pHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 桑色素對XO的抑制作用

參考Yan Jiakai等[10]的實驗方法，將7.5×10－8mol/L XO和不同濃度的桑色素于37 ℃條件下孵化2.5 h，放至室溫后加入一定濃度（5.0×10－5mol/L）的底物黃嘌呤，測定295 nm波長處的光密度值，計算含不同濃度桑色素體系中XO的相對活性。

固定底物濃度（5.0×10－5mol/L），測定不同濃度桑色素條件下，酶活力（用’OD295nm表示，下同）隨XO濃度的變化，根據其相關性判斷桑色素對XO的抑制可逆性。

固定XO濃度（7.5×10－8mol/L），測定不同濃度桑色素條件下，’OD295nm隨底物濃度的變化，以Lineweaver-Burk雙倒數方程作圖，判斷桑色素對XO的抑制類型，并計算抑制常數（Ki）。

1.2.2 桑色素與XO作用的熒光光譜和圓二色譜研究

在2 mL反應體系中，固定XO濃度，逐次加入一定體積（5 ?L/次）桑色素溶液，混合均勻后靜置5 min，分別掃描XO和桑色素-XO體系的熒光光譜（激發波長為280 nm，激發和發射狹縫均為5 nm）。

在190～250 nm波長范圍內，分別測定不同濃度比的桑色素-XO體系的圓二色譜。通過在線Dichroweb軟件（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）計算與桑色素作用前后XO的二級結構含量。

1.2.3 分子 模擬

根據文獻[11]下載XO的晶體模型（PDB ID: 3ETR），并利用Chem3D Ultra 8.0軟件獲得桑色素的3D結構。通過AutoDock4.2軟件結合Lamarckian Genetic Algorithm算法[12]進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 桑色素對XO的抑制率

圖1 桑色素對XO的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect on XO of morin

如圖1所示，隨著桑色素的加入，XO的相對活性不斷降低，桑色素對酶的抑制作用呈現一定的濃度依賴關系；桑色素和別嘌呤醇（陽性對照）的IC50分別為1.35×10–5mol/L和1.79×10–6mol/L，表明桑色素對XO具有一定的抑制效果，其IC50與Yu Zhifeng等[9]得到的IC50值為（1.80±0.25）×10–5mol/L一致。

2.2 桑色素對XO的抑制類型分析

圖2 桑色素對XO的抑制可逆性Fig.2 Inhibitory reversibility of morin on XO

由圖2可逆性實驗結果可知，不同濃度桑色素存在下，’OD295nm與XO濃度變化為線性關系且都經過原點，表明桑色素對XO的抑制作用是可逆的[13]。

根據Lineweaver-Burk雙倒數方程作圖（圖3）得一組相交于第二象限的直線，桑色素的存在引起酶的Km值增大，Vm值減小，表明桑色素對XO抑制類型為混合抑制[14]。以直線的斜率和截距對桑色素濃度作圖（圖3插圖），均呈現良好的線性關系，表明桑色素在XO上只有一個結合位點[15]。計算出Ki和抑制系數（α）分別為1.21×10–5mol/L和1.94。

圖3 桑色素對XO的抑制類型Fig.3 Inhibitory type of morin on XO

2.3 桑色素猝滅XO的熒光光譜

圖4 桑色素-XO體系的熒光猝滅圖和Stern-Volmer圖Fig.4 Fluorescence quenching spectra and Stern-Volmer plot (inset) of morin-XO system

圖4 顯示XO在342 nm波長處有一強的熒光發射峰（主要由色氨酸和酪氨酸產生）。隨著溶液中桑色素濃度不斷增加，XO的熒光峰強度逐漸降低，但峰的位置沒有發生移動，表明桑色素與XO發生了相互作用，但對色氨酸和酪氨酸微環境的極性沒有明顯的影響[16]。

表1 不同溫度下桑色素-XO體系的猝滅常數（Ksv）、結合常數（Ka）、結合位點數（n）及熱力學參數Table 1 Quenching constant (Ksv), association constant (Ka), the number of binding sites (n) and thermodynamic parameters of morin-XO system at different temperatures

根據Stern-Volmer及其修正方程[17]：F0/F = 1+Kqτ0[Q] = 1+Ksv[Q]，F0/（F0－F） = （1/”aKa[Q]）+1/”a，lg[（F0－F）/F]= lgKb+nlg[Q]，分別求得3 個溫度（298、304、310 K）條件下的猝滅常數（Ksv）、結合常數（Ka）和結合位點數（n），列于表1中。Ksv隨著溫度的升高而減小且猝滅速率常數Kq值遠大于生物分子的最大擴散速率常數值（2×1010L/（mol·s））[18]，表明桑色素對XO熒光猝滅為形成桑色素-XO復合物的靜態猝滅過程。不同溫度下結合位點數n≈1，表明桑色素在XO上存在唯一的結合位點，與抑制類型分析結果一致。

由熱力學關系式：l g Ka=－’H/2.3 0 3 R T+’S/2.303R，’G = ’H－T’S，求得焓變（’H）、熵變（’S）和生成自由能變（’G），結果如表1所示。’G＜0，表明桑色素與XO的作用過程是一個Gibbs自由能降低的自發過程，’H＞0、’S＞0，表明桑色素與XO的結合是一個吸熱和熵驅動過程[19]，疏水作用力是桑色素與XO結合的主要驅動力[20]。

2.4 桑色素對XO二級結構的影響

圖5 桑色素-XO體系的圓二色譜圖Fig.5 CD spectra of morin-XO system

圖5 顯示XO在216 nm波長處有明顯的負峰（β-折疊特征峰）[21]，當加入桑色素后峰強度減?。ㄏ蛄闼揭苿樱?，但峰位置未發生變化，表明桑色素誘導XO結構發生一定的變化。通過在線SELCON3程序計算出XO與桑色素作用前后的二級結構含量（表2）。桑色素的加入引起XO的α-螺旋和β-轉角含量有稍許升高，而β-折疊和無規則卷曲含量顯示一定的降低，表明桑色素與XO結合導致XO的二級結構更加緊密，抑制了酶活性中心的形成[10]。

表2 桑色素存在下XO的二級結構含量Table 2 Secondary structure contents of XO in the presence of morin

2.5 分子模擬

為了直觀地展現桑色素與XO的結合模式和空間結構，利用分子模擬技術進行分析。圖6A是進行100次分子對接所產生的39 個結合區域（能量簇），每個柱形表示在該區域結合的次數，其中結合次數最多的區域結合可能性最大，且結合能量越低復合物結構越穩定，因此將結合次數最多（27 次）且結合能最低（-3.66 kcal/mol）時的結合姿態作為桑色素與XO結合的分析模型，如圖6B所示。桑色素分子進入XO的疏水空腔，其B環插入到疏水性氨基酸殘基Phe914、Phe1014和Phe649之間，與它們形成π—π共軛體系，這在XO識別配體過程中起重要作用[22]。此外，桑色素的苯并呋喃環與活性中心（含Mo區域）周圍的其他主要氨基酸殘基Ser1075、Pro1076、Asn768、Lys771、Leu648和Leu1014等發生作用。表明桑色素主要通過疏水作用力與活性中心附近的氨基酸殘基發生作用，這與熱力學分析結果一致。

圖6 桑色素與XO的分子對接Fig.6 The molecular docking of morin and XO

3 結 論

實驗結果表明，桑色素是一種可逆的混合型抑制劑，其半數抑制濃度和抑制常數分別為1.35×10–5mol/L和1.21×10–5mol/L。桑色素進入XO的疏水腔，通過疏水作用力與XO活性中心周圍的主要氨基酸殘基發生作用，并誘導XO的二級結構發生改變。推測桑色素進入XO的疏水腔，占據了底物黃嘌呤進入活性中心的通道，并使XO的結構更加緊密不利其形成活性中心，從而有效地抑制了XO對黃嘌呤的催化活性。

[1] 展鵬, 劉濤, 劉新泳. 以黃嘌呤氧化酶為靶點的新型非嘌嘌呤類抗痛風及高尿酸血癥藥物研究進展[J]. 中國藥物化學雜志, 2012, 22(5): 403-415.

[2] 陸明, 張嶺, 王茵. 高尿酸血癥的發病機制以及黃酮類膳食對其干預作用[J]. 中國預防醫學雜志, 2012, 13(8): 632-634.

[3] 王春輝, 李松. 黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進展[J]. 國外醫學:藥學分冊, 2006, 33(5): 351-354.

[4] SORBERA L A, REVEL L, RABASSEDA X. Treatment of g out and hyperuricemia xanthine oxidase inhibitor[J]. Drugs Future, 2001, 26(1): 32-38.

[5] MENDOZA-WILSON A M, SANTACRUZ-ORTEGA H, BALANDR?N-QUINTANA R R. Relationship between structure, properties, and the radical scavenging activity of morin[J]. Journal of Molecular Structure, 2011, 995(1): 134-141.

[6] PANHWAR Q K, MEMON S, BHANGER M I. Synthesis, characterization, spectroscopic and antioxidation studies of Cu (II)-morin complex[J]. Journal of Molecular Structure, 2010, 967(1): 47-53.

[7] MAKRIS D P, ROSSITER J T. Hydroxyl free radical-mediated oxidative degradation of quercetin and morin: a preliminary investigation[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2002, 15(1): 103-113.

[8] WO?NICKA E, KOPACZ M, UMBREIT M, et al. New complexes of La (Ⅲ), Ce (Ⅲ), Pr (Ⅲ), Nd (Ⅲ), Sm (Ⅲ), Eu (Ⅲ) and Gd (Ⅲ) ions with morin[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2007, 101(5): 774-782.

[9] YU Zhifeng, FONG W P, CHENG C H K. The dual actions of morin (3, 5, 7, 2’, 4’-pentahydroxyflavone) as a hypouricemic agent: uricosuric effect and xanthine oxidase inhibitory activity[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2006, 316(1): 169-175.

[10] YAN Jiakai, ZHANG Guowen, HU Yuting, et al. Effect of luteolin on xanthine oxidase: inhibition kinetics and interaction mechanism merging with docking simulation[J]. Food Chemistry, 2013, 141(4): 3766-3773.

[11] NONGONIERMA A B, MOONEY C, SHIELDS D C, et al. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV and xanthine oxidase by amino acids and dipeptides[J]. Food Chemistry, 2013, 141(1): 644-653.

[12] MORRIS G M, GOODSELL D S, HALLIDAY R S, et al. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function[J]. Journal of Computational Chemistry, 1998, 19(14): 1639-1662.

[13] 龔盛昭. 肉桂腈抑制酪氨酸酶活性的動力學研究[J]. 食品科技, 2012, 36(12): 10-13.

[14] FUKUNARI A, OKAMOTO K, NISHINO T, et al. Y-700 [1-[3-cyano-4-(2, 2-dimethylpropoxy) phenyl]-1H-pyrazole-4-carboxylic acid]: a potent xanthine oxidoreductase inhibitor with hepatic excretion[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2004, 311(2): 519-528.

[15] WANG Zhijiang, LEE J, SI Yuexiu, et al. Toward the inhibitory effect of acetylsalicylic acid on tyrosinase: integrating kinetics studies and computational simulations[J]. Process Biochemistry, 2013, 48(2): 260-266.

[16] GUO Xingjia, JING Kui, GUO Chuang, et al. The investigation of the interaction between oxybutynin hydrochloride and bovine serum albumin by spectroscopic methods[J]. Journal of Luminescence, 2010, 130(12): 2281-2287.

[17] LU Yan, WANG Gongke, LU Xiumin, et al. Molecular mechanism of interaction between norfloxacin and trypsin studied by molecular spectroscopy and modeling[J]. Spectrochimica Acta Part A, 2010, 75(1): 261-266.

[18] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy[M]. 3rd ed. New York: Springer, 2006: 277-285.

[19] ZHANG Guowen, CHEN Xiuxia, GUO Jinbao, et al. Spectroscopic investigation of the interaction between chrysin and bovine serum albumin[J]. Journal of Molecular Structure, 2009, 921(1): 346-351.

[20] ROSS P D, SUBRAMANIAN S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry, 1981, 20(11): 3096-3102.

[21] HADIZADEH M, KEYHANI E, KEYHANI J, et al. Functional and structural alterations induced by copper in xanthine oxidase[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2009, 41(7): 603-617.

[22] TUNG Y T, HSU C A, CHEN C S, et al. Phytochemicals from Acacia confusa heartwood extracts reduce serum uric acid levels in oxonateinduced mice: their potential use as xanthine oxidase inhibitors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(18): 9936-9941.

Inhibition Effect of Morin on Xanthine Oxidase Activity

WANG Ya-jie, ZHANG Guo-wen*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The inhibition mechanism of morin on xanthine oxidase (XO) in phosphate buffer (pH 7.5) was investigated by UV-vis absorption, fluorescence and circular dichroism spectroscopy combined with molecular simulation technique. The results showed that morin could be a good reversible XO inhibitor in a mixed-type manner with an inhibitory oncentrationleading to a 50% loss in the activity (IC50) and an inhibition constant (Ki) of 1.35 × 10–5mol/L and 1.21 × 10–5mol/L,respectively. Strong fluorescence quenching and secondary str ucture changes of XO were observed due to the formation of a complex with morin. The results from molecular simulation have further confirmed that morin was mainly bound to the active site of XO where it interacted with some primary amino acid residues such as Phe914, Phe649, Phe1009, Leu648, Leu1014, Leu873, etc. by hydrophobic force. It could be concluded that morin inhibited XO catalytic activity by entering into XO’s hydrophobic cavity, blocking the insertion of substrate xanthine and influencing the formation of active center.

morin; xanthine oxidase; inhibition kinetics; binding characteristics; spectroscopic techniques; molecular simulation

TS207.3

A

1002-6630（2014）13-0143-04

10.7506/spkx1002-6630-201413027

2014-05-09

國家自然科學基金地區科學基金項目（31060210）；江西省自然科學基金項目（20142BAB204001）；

食品科學與技術國家重點實驗室項目（SKLF-ZZB-201305；SKLF-ZZA-201302；SKLF-KF-201203）

王亞杰（1988—），男，碩士，研究方向為功能食品開發與利用。E-mail：1025579088@qq.com

*通信作者：張國文（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品安全與食品化學。E-mail：gwzhang@ncu.edu.cn