Fenton體系的優化及其對酪蛋白的氧化作用

劉建壘，景 浩*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 10 0083）

Fenton體系的優化及其對酪蛋白的氧化作用

劉建壘，景 浩*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 10 0083）

酪蛋白是乳與乳粉中的主要蛋白組分，在加工和貯藏過程中會發生氧化反應從而影響產品的品質。研究Fenton體系誘導的酪蛋白氧化后化學及結構特性的變化。首先對Fenton體系中Fe2+濃度、抗壞血酸（ascorbic acid，Asc）濃度、H2O2濃度進行了優化，以酪蛋白為靶分子，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究了Fenton體系主要成分以及體系的溫度和時間對酪蛋白氧化程度的影響；并進一步研究了氧化后酪蛋白的溶解性、變性程度、總巰基含量及羰基含量的變化。結果表明：當Fenton體系中Fe2+濃度為0.8 mmol/L，EDTANa2濃度為1 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L，Asc濃度為0.8 mmol/L，酪蛋白質量濃度為5 mg/mL，37 ℃條件下加熱4 h時，酪蛋白氧化程度最明顯。隨著Fe2+濃度、Asc濃度、H2O2濃度、氧化溫度的升高和氧化時間的延長，酪蛋白4 個組分條帶的密度均逐漸減小，并在相應的高分子區域出現逐漸致密的新條帶；但隨著酪蛋白質量濃度的升高，酪蛋白條帶的變化減小。酪蛋白氧化后，其溶解度和巰基含量顯著降低，變性程度和羰基含量顯著升高。綜上所述，酪蛋白氧化后發生蛋白交聯和氨基酸功能基團變化，導致蛋白的變性程度增大以及溶解度下降。

酪蛋白；Fenton體系；氧化；優化；化學及結構特性

酪蛋白是牛奶蛋白的主要組分，約占乳中蛋白的80%[1]。酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白4 個組分組成，在脫脂乳中的含量分別為12～15、3～4、9～11、2～4 g/L[2]。乳中酪蛋白是以膠體粒子的形式存在，直徑在50～600 nm（平均直徑約為150 nm），又被稱為“酪蛋白膠束”（casein micelles）[3]。酪蛋白含有較多的磷酸殘基，易與鈣離子結合形成膠體磷酸鈣，有助于維持酪蛋白膠束的穩定性[4]。酪蛋白在食品工業中應用廣泛，添加酪蛋白有助于增加食品的風味，還可以改善產品的乳化性、攪打性、保水性及黏度等特性[4]。其中αs-酪蛋白和β-酪蛋白有助于維持熱加工過程中蛋白質的穩定性，并防止蛋白質的聚集、沉淀和凝膠[5]，對乳飲料加工具有重要意義。

乳制品在加工及貯藏過程中可發生蛋白氧化，影響產品的品質。目前采用的乳蛋白氧化體系有類Fenton體系（Fe3+-H2O2-Asc）[6]、核黃素誘導的光氧化[7]、紫外線照射[8-9]、乳過氧化物酶體系（lactoperoxidase-H2O2）[10]及多不飽和脂肪酸光氧化體系[11]等。乳蛋白氧化后其顏色加深[9]，蛋白溶液混濁度升高，巰基含量減少[6]，羰基含量增加[6-7,11]，二酪氨酸含量增加[6,10]，表面疏水性增大[6]。乳蛋白氧化后，其構象發生變化，容易被胃蛋白酶水解[8]；還會發生聚合反應，生成二聚體或多聚體[6-7,9,11]。氧化作用還可以使芳香族氨基 酸生成N-甲酰犬尿氨酸或二酪氨酸[8]。總之，氧化反應不僅使乳蛋白的營養價值下降，還會造成乳蛋白的功能特性及流變學特性發生變化，如乳清蛋白的溶解性降低，蛋白凝膠的硬度及彈性下降，但乳化性和起泡性等表面特性有所改善[12]。

Fenton試劑指的是亞鐵鹽和過氧化氫的組合，是由英國人Fenton在1894年首先研究報道的，其實質是H2O2在Fe2+的催化作用下生成具有高反應活性的羥自由基（·OH）[13]。之后研究發現其他金屬離子，如Fe3+、Cu+、Ti3+、Cr2+、Co2+等，也具有Fenton試劑的氧化特性，被稱為類Fenton試劑[14]。加入抗壞血酸能夠將Fe3+還原為Fe2+，進而加快Fenton體系產生·OH的速率[15]。以往的研究主要集中在蛋白氧化后結構及功能特性的改變等方面，對Fenton體系主要成分的使用濃度的報道差異較大。目前文獻中報道的Fenton體系多為Fe3+-H2O2-Asc體系，但其中各組分使用的濃度不同，Fe3+濃度范圍在0.01～0.1 mmol/L間，Asc濃度在0.1～1 mmol/L間，H2O2濃度在0.5～20 mmol/L間，在這些條件下均可以導致乳清蛋白或肌動球蛋白的氧化交聯[6,16-17]。也有報道采用Fe2+-H2O2體系，其中采用Fe2+濃度為40、80 μmol/L或2.5 mmol/L，H2O2濃度為0.8、50 mmol/L，它們均可導致色氨酸或牛血清白蛋白的氧化[18-19]。而對Fenton體系（Fe2+-H2O2-Asc）中Fe2+、H2O2、Asc的濃度對酪蛋白氧化的影響未見報道，因此Fenton體系中各組分濃度對酪蛋白氧化的影響研究不但可對蛋白氧化的實驗研究提供參考，還對控制蛋白氧化的條件提供理論依據。

本實驗首先對Fenton體系中影響酪蛋白氧化的主要因素進行了研究，包括Fenton體系中Fe2+濃度、Asc濃度、H2O2濃度，及體系的作用溫度和時間、以及酪蛋白本身的濃度對酪蛋白氧化程度的影響；并進一步研究了氧化后化學及結構特性的變化，包括酪蛋白的溶解性、變性程度、總巰基含量及羰基含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白（casein，CN）、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-ddithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB）美國Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）第Ⅴ組分 美國Amresco公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 國藥集團；L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，Asc） 西隴化工股份有限公司；蛋白染色液（dye reagent concentrate，DRC）美國Bio-Rad公司；低分子質量標準蛋白Marker（含6 種標準蛋白，分子質量從大到小依次為：兔磷酸化酶B 97.4 ku、牛血清白蛋白66.2 ku、兔肌動蛋白43 ku、牛碳酸酐酶31 ku、人生長激素22 ku、雞蛋清溶菌酶14.4 ku） 中國科學院上海生命科學研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pHS-3C+酸度計 成都世紀方舟科技有限公司；68 0型酶標儀 美國Bio-Rad公司；HY-2A數顯調速多用振蕩器、HJ-1磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；CU-420型電熱恒溫水箱 上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16B 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；UV-1200型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的氧化

參考程恒等[20]的方法，簡述如下，用pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）（含NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4的濃度分別為137、2.7、10、2 mmol/L）配制各儲備液，向50 mL離心管中依次加入0.05～0.5 mL 20 mmol/L的FeSO4溶液、0.5 mL 20 mmol/L的EDTANa2溶液、0.05～2 mL 100 mmol/L的 H2O2溶液、0.05～0.5 mL 20 mmol/L的Asc溶液，迅速加入0.8～8 mL 12.5 mg/mL的酪蛋白溶液，加PBS至體積為10 mL，徹底混勻（溶液體系共10 mL，其中酪蛋白質量濃度為1～10 mg/mL，FeSO4為0.1～1.0 mmol/L，EDTANa2為1 mmol/L，H2O2為0.5～20 mmol/L，Asc為0.1～1.0 mmol/L）。將樣品迅速均勻分裝到2 個15 mL離心管中，分別放入25、37 ℃水浴條件下進行氧化反應。分別在2、4、6 h時取出一組樣品并將各溶液放入－20 ℃冰箱中冷凍，待測。同時以未氧化的酪蛋白溶液作空白對照。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參考J i n g H a o等[21]的方法，簡述如下，用SDS-PAGE對樣品進行檢測。依次在凝膠板中加入7 mL的15 g/100 mL分離膠和2 mL的5 g/100 mL濃縮膠，凝膠厚度1.5 mm。將蛋白樣品溶液預先標準化為2 mg/mL，取20 ?L樣品溶液與20 ?L上樣緩沖液（含2 g/100 mL SDS和2%（V/V）β-巰基乙醇，40%（V/V）甘油，0.02 g/100 mL溴酚藍的Tris-HCl緩沖溶液，pH 6.8）混勻，80 ℃水浴加熱5 min，上樣量為10 ?L，用DYY-8C型電泳儀進行穩壓電泳，起始電壓為80 V，當樣品進入分離膠與濃縮膠交界處時，將電壓調到110 V，當溴酚藍指示劑跑到距膠底部5 mm時（約1.5 h），停止電泳。剝下膠片后，用0.025 g/100 mL考馬斯亮藍R-250染色液（甲醇、乙酸、水體積比5∶1∶4）染色6 h，用脫色液（甲醇、乙酸、水體積比2∶1∶7）脫色至條帶清晰可見，用凝膠成像儀拍照，分析。

非還原SDS-PAGE中上樣緩沖液中不加β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME），其他同上。

1.3.3 蛋白溶解度的測定

參考Daimer等[22]的方法，簡述如下，蛋白質溶解度用離心后樣品上清液中蛋白質含量與樣品總蛋白質含量的之比表示。測定前將樣品用含有PBS緩沖溶液稀釋至蛋白質含量為5 mg/mL，室溫下緩慢攪動1 h，使體系充分平衡。先取部分懸浮液用于測定總蛋白質含量（total protein content，Pt），再將剩余的溶液在10 000×g條件下離心10 min。不溶物沉淀在管底，上清液中蛋白為可溶性蛋白，測定其含量（soluble protein content，Ps）。蛋白質含量用Bradford方法測定。溶解度計算見公式（1）。

1.3.4 蛋白變性程度的測定

參考Daimer等[23]的方法，簡述如下，測定前將樣品用PBS緩沖溶液稀釋至蛋白質含量為5 mg/mL，室溫下緩慢攪動1 h，使體系充分平衡。同時，用10 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將酪蛋白溶液的pH值調至8.0。先取部分蛋白溶液用于測定總蛋白質含量（Pt），再將剩余的溶液在10 000×g條件下離心10 min。不溶物沉在管底，上清液包含可溶性物質用以測定蛋白含量（Ps），蛋白質含量用Bradford方法測定。變性程度計算見公式（2）。

1.3.5 總巰基含量的測定

參考Aitken等[24]的方法，簡述如下，所需儲備液1）反應緩沖液：含1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L PBS， pH 8.0；2）變性緩沖液：含6 mol/L 鹽酸胍，1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L Na2HPO4的緩沖溶液pH 8.0；3）Ellman’s溶液：用反應緩沖液配制10 mmol/L（4 mg/mL）的DTNB，新鮮配制。

用反應緩沖液配制濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L的半胱氨酸標準溶液，將樣品溶液調pH值至8.0。準備一套離心管，分別加入20 μL的Ellman’s試劑溶液和1 mL的變性緩沖液，再依次加入100 μL的半胱氨酸標準溶液或樣品溶液。混勻，室溫下暗處放置15 min后，以反應緩沖液為參比，測定412 nm波長處的吸光度。以半胱氨酸標準溶液的濃度對其吸光度做標準曲線，進而得到樣品溶液的總巰基含量。

1.3.6 羰基含量的測定

參考Wehr等[25]的方法，簡述如下，取0.4 mL的蛋白樣品溶液于1.5 mL離心管中，加入0.4 mL 0.2% DNPH溶液（含2 mol/L HCl），漩渦振蕩，充分混勻，對照組加入0.4 mL 2 mol/L的HCl，其余操作相同；將混合液在室溫下避光放置10 min，每2 min漩渦振蕩1 次。加入0.2 mL 100 g/100 mL三氯乙酸（體系中最終含量為20 g/100 mL），2 000×g離心2 min，小心去除上清液；加入1 mL的乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液，漩渦振蕩，使蛋白分散，立即在5 000×g離心2 min，去除上清液，如此洗滌沉淀3 次以除去游離的DNPH；再將所得沉淀溶解在1 mL 6 mol/L的鹽酸胍（含20 mmol/L K3P O4，pH 2.5）溶液中，37 ℃水浴15 min，使蛋白質完全溶解，6 000×g離心3 min。以6 mol/L的鹽酸胍（含20 mmol/L K3PO4，pH 2.5）為空白，在370 nm波長處測上清液吸光度，并用Bradford法測上清液中的蛋白質的含量。羰基含量按朗伯比爾定律計算，見公式（3）。

式中：ΔA為樣品A370nm－對照A370nm；ζ為產物腙的摩爾吸光系數，在此溶液中值為22 000 L/（mol?cm）；b為比色皿光徑/cm；c為羰基含量，羰基含量用nmol/mg pro表示。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 Fe2+濃度對酪蛋白氧化的影響

酪蛋白含4 個條帶，從上到下依次為αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，由于αs2-酪蛋白和αs1-酪蛋白的分子質量比較接近，故這兩個條帶區分并不明顯（圖1A1）。氧化后，酪蛋白4 個組分的條帶密度均減小，并在高分子區域出現新條帶，且Fenton體系中Fe2+濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍時，隨Fe2+濃度的增大、氧化溫度的升高及氧化時間的延長，酪蛋白4 個組分條帶的密度均逐漸減小，并在相應的高分子區域出現逐漸致密的新條帶（圖1）。在37 ℃條件下反應4 h后，Fe2+濃度為0.8 mmol/L時，高分子區域條帶密度顯著增加，在非還原電泳圖譜中，相對應的條帶有部分蛋白聚集在點樣孔，而未進入濃縮膠（圖1B2）；而在還原電泳圖譜中，點樣孔處的蛋白含量增加不明顯（圖1A2）。圖1B1、1B2與圖1A1、1A2對比還可以看出，非還原電泳的電泳圖譜要比還原電泳的電泳圖譜少1 條分子質量較小的條帶，即κ-酪蛋白缺失。

圖1 Fe 1 Fe2+2+對酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜EFig.1 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of Fe2+

酪蛋白的組成中αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白各自含有兩個—SH基團，由于兩分子間的二硫鍵的作用，天然的αs2-酪蛋白大多以二聚體的形式存在，而天然的κ-酪蛋白則是以一系列由二硫鍵形成的多聚體的形式存在[26-27]。此外，αs1-和β-酪蛋白均可和κ-酪蛋白形成復合物[28]。酪蛋白的還原電泳圖譜中多了1 個條帶，是因為加入的β-巰基乙醇能將聚合狀態的κ-酪蛋白中的二硫鍵斷裂，形成κ-酪蛋白單體的緣故。酪蛋白氧化后發生交聯或聚集，分子質量增大；但在還原電泳圖譜中，點樣孔處的蛋白含量增加不明顯，是因為加入的β-巰基乙醇能將產生的交聯蛋白中的二硫鍵還原，從而降低了其分子質量；而在還原電泳圖譜中仍然存在較多的高分子區域新條帶，可能是酪蛋白中的酪氨酸通過共價鍵結合形成二酪氨酸產生的交聯蛋白[6,29]，且有研究表明二酪氨酸主要是由α-酪蛋白和β-酪蛋白的氧化生成的[7,30]。Samagoto等[9]研究認為牛奶濃縮蛋白粉在紫外光氧化作用下產生的高分子質量蛋白聚合物主要是由于酪蛋白氧化產生的非二硫鍵共價交聯；而Wang Yaosong等[16]認為乳清蛋白在Fenton體系中氧化后發生的交聯主要是通過二硫鍵的形式產生的，本研究結果與前者更符。

2.2 H2O2對酪蛋白氧化的影響

圖 22 HH2O2對酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of H2O2

根據Asc濃度的優化實驗，在Asc 0.8 mmol/L的條件下研究了H2O2濃度在0.5～20 mmol/L時酪蛋白氧化程度的影響。結果表明，隨H2O2濃度的增大、氧化溫度的升高和氧化時間的延長，酪蛋白各條帶密度逐漸減少，高分子區域條帶密度逐漸增加（圖2），且變化程度比不同濃度的Fe2+、Asc的影響更顯著。當H2O2濃度小于1 mmol/L時，產生的羥自由基較少，對酪蛋白的氧化作用較小；當H2O2濃度大于5 mmol/L后，隨H2O2濃度的增大，產生的羥自由基數量增加，對酪蛋白的氧化作用加大；其中在H2O2濃度為10 mmol/L時，氧化4 h后，酪蛋白的非還原電泳圖譜中，有大量蛋白聚集在點樣孔，而未進入濃縮膠（圖2B1、2B2），表明酪蛋白發生了部分交聯或聚集，分子質量增大；而當H2O2濃度為20 mmol/L時，酪蛋白溶液變得十分混濁，并產生部分沉淀，溶液中的蛋白含量急劇下降。

H2O2是Fenton體系產生羥自由基的直接來源，故其濃度對蛋白氧化的影響非常大。Cui Xuhai等[6]研究結果也表明H2O2濃度大于5 mmol/L時乳清蛋白氧化產生明顯的交聯，H2O2濃度為20 mmol/L時溶液混濁度（A600nm）最大，且蛋白含量急劇減少，本研究與其結果是一致的。

2.3 Asc對酪蛋白氧化的影響

圖3 Asc對酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of Asc

在Fenton體系中，研究了在H2O2為20 mmol/L 條件下，Asc濃度的變化（0.1～1.0 mmol/L）對酪蛋白氧化程度的影響。結果顯示，Asc濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內，隨Asc濃度的增大、氧化溫度的升高和氧化時間的延長，酪蛋白4 個組分的條帶密度均逐漸減少，高分子區域條帶密度逐漸增加（圖3），表明酪蛋白的氧化程度逐漸加劇。在37 ℃條件下加熱4 h后，當Asc濃度為0.8 mmol/L時，酪蛋白含量開始明顯減少，且高分子區域條帶密度增加（圖3A2）；但在非還原電泳圖譜中，相對應的條帶有部分蛋白聚集在點樣孔，而未進入濃縮膠（圖3B2），表明酪蛋白發生了部分交聯或聚集，分子質量增大。氧化6 h后，酪蛋白4 個組分的含量均明顯減少，高分子區域條帶密度明顯增加，且有大量的蛋白聚集在點樣孔，氧化作用非常明顯。

Nappi等[31]的研究證實Asc濃度在0.1～0.2 mmol/L時，能夠促進金屬離子的再生，進而使Fenton體系中H2O2能在Fe2+的催化作用下產生更多的羥自由基。此外，由于Asc在溶液中呈酸性，而Kremer[32]研究發現Fenton體系在較低pH值時O2的釋放量減少，也就是說Asc濃度增大時，Fenton體系的pH值降低，H2O2分解產生的O2減少，從而有更多的H2O2參與產生羥自由基的反應，進而促進了酪蛋白的氧化。

2.4 酪蛋白質量濃度對酪蛋白氧化的影響

圖4 酪蛋白質量濃度對酪蛋白氧化作用影響的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of casein in Fenton reaction system with different concentrations of casein

隨酪蛋白質量濃度的增大，酪蛋白各條帶密度逐漸增加，高分子區域條帶密度逐漸減少（圖4），表明酪蛋白的氧化程度逐漸減弱。當酪蛋白質量濃度低于5 mg/mL時，37 ℃氧化4 h后，酪蛋白的非還原電泳圖譜中，均有大量蛋白聚集在點樣孔，而未進入濃縮膠（圖4B2）；當酪蛋白質量濃度大于8 mg/mL時，氧化生成的高分子質量聚合物的含量開始減少，氧化作用有所減弱。表明酪蛋白在低質量濃度時更容易被氧化，且隨氧化溫度的升高和氧化時間的延長，氧化程度均逐漸加劇。

由于酪蛋白是牛奶各組分中起抗氧化作用的主要蛋白[33]，在確定的體系中，Fenton體系產生羥自由基的數量是一定的，當體系中酪蛋白質量濃度增大時，能夠清除部分自由基，從而減少羥自由基對酪蛋白本身的氧化損傷。

綜合以上實驗結果可以看出，Fenton體系中酪蛋白質量濃度為5 mg/mL，FeSO4濃度為0.8 mmol/L，EDTANa2濃度為1 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L，Asc濃度為0.8 mmol/L，37 ℃條件下加熱4 h對酪蛋白的氧化作用非常明顯。

本研究采用Fe2+-H2O2-Asc體系，其中Fe2+濃度為0.8 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L，比Utrera等[18]采用的Fe2+-H2O2體系（含40或80 μmol/L Fe2+，0.8 mmol/L H2O2）中的Fe2+和H2O2的濃度都要高；但比Bian Chunli等[19]研究的Fe2+-H2O2體系（含2.5 mmol/L Fe2+，50 mmol/L H2O2）中的Fe2+和H2O2的濃度都要低。本研究優化得到的Asc濃度為0.8 mmol/L，比Cui Xuhai等[6]采用的Fe3+-H2O2-Asc體系（含0.1 mmol/L Asc）中的Asc的濃度高，但比Wang Yaosong等[16]研究的Fe3+-H2O2-Asc體系（含1 mmol/L Asc）中的Asc濃度低。本研究的反應溫度為37 ℃，比上述4 項研究中采用的室溫條件也要高；本研究需要的酪蛋白質量濃度為5 mg/mL，比Cui Xuhai等[6]研究的乳清蛋白質量濃度為20 mg/mL低很多，這可能與酪蛋白具有較強的抗氧化作用有關。

乳與乳粉中均含有一定量的鐵及抗壞血酸，但其含量較本實驗中采用的濃度低，在H2O2存在下仍會發生Fenton反應，導致乳蛋白的氧化。因此在乳與乳粉的貯藏及加工過程中應盡量避免接觸H2O2等氧化劑。

2.5 酪蛋白氧化對化學及結構特性的影響

表1 酪蛋白氧化對化學及結構特性的影響Table 1 Changes in chemical and structural properties of casein after oxidattiioonn

由表1可知，酪蛋白氧化后溶解度下降了28.4%，變性程度增加了6.4 倍，總巰基含量下降了41.9%，羰基含量增加了近10 倍，進一步表明酪蛋白在Fenton體系中很容易被氧化。

本研究的結果與Cui Xuhai等[6]研究的乳清蛋白的各氧化指標的變化趨勢一致，但本研究采用的Fenton體系對蛋白氧化更敏感。氧化后酪蛋白總巰基的含量減少，這是因為酪蛋白的組成中αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白各自含有兩個—SH基團[26-27]，在Fenton體系中很容易被氧化發生交聯，這與SDS-PAGE的結果是一致的。α-酪蛋白和β-酪蛋白是無規則卷曲蛋白，最容易被氧化形成羰基，其中色氨酸、組氨酸，蛋氨酸中的羰基含量增加明顯[7]。此外，賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸的氧化也可形成羰基[29-30]。

3 結 論

在Fenton體系中，增加Fe2+、H2O2及Asc濃度的均能促進酪蛋白的氧化；升高溫度及延長氧化時間也能促進酪蛋白的氧化；但當酪蛋白質量濃度增高時，體系對酪蛋白的氧化作用減弱。酪蛋白氧化后發生交聯生成蛋白聚合物；氧化還造成酪蛋白的氨基酸功能基團發生變化，如巰基含量減少，氨基酸殘基氧化生成羰基，這些可導致酪蛋白的變性程度增大以及溶解度下降。本實驗對影響酪蛋白氧化的因素的研究，為有效地控制乳蛋白在貯藏及加工過程中的氧化反應及減少產品品質劣變提供理論依據和研究基礎。

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Optimization of Fenton Reaction System and Its Inductive Effect on Casein Oxidation

LIU Jian-lei, JING Hao*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Casein consists of about 80% of the proteins of milk or milk powder, which is susceptible to oxidation during food processing and storage. Fenton reaction-induced casein oxidation and the associated chemical and structural changes were investigated. The effects of the main components in the Fenton reaction system as well as reaction temperature and time on casein oxidation were investigated by using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the conc entrations of Fe2+, ascorbic acid, and H2O2were optimized. Fenton reaction-induced casein oxidation and its chemical and structural changes were assessed by changes in solubility, degree of protein denaturation, and total sulfhydryl and carbonyl contents of casein. Results showed that casein was oxidized to a great degree in the Fenton system containing 0.8 mmol/L FeSO4, 1 mmol/L EDTANa2, 10 mmol/L H2O2, 0.8 mmol/L ascorbic acid, 5 mg/mL casein after incubation at 37 ℃ for 4 h. The electrophoretic patterns indicated decreases in band intensity of casein and increases in density of the high molecular weight (HMW) protein bands. These changes were greater with increasing concentrations of Fe2+, ascorbic acid, and H2O2in the Fenton reaction sy stem as well as temperature and time. Smaller changes in the casein bands were seen with increasing its concentration. Solubility and total sulfhydryl content were decreased, and degree of protein denaturation and carbonyl content were increased after oxidization of casein. In conclusion, casein oxidation leads to cross-linking into high molecular weight (HMW) substances and modification of functional groups of amino acid residues, which consequently results in decreased protein solubility and increased protein denaturation degree.

casein; Fenton reaction system; oxidation; optimization; chemical and structural properties

TS252.1

A

1002-6630（2014）13-0074-07

10.7506/spkx1002-6630-201413014

2014-06-15

“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2011BAD09B0302）

劉建壘（1987—），男，博士研究生，研究方向為乳蛋白的品質控制。E-mail：liujianlei@cau.edu.cn

*通信作者：景浩（1957—），男，教授，博士，研究方向為分子營養與食品安全。E-mail：haojing@cau.edu.cn