食物過敏動物模型的研究進展

黃建芳，王彩霞，向軍儉*，鄭 函

（暨南大學 廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣東 廣州 510632）

食物過敏動物模型的研究進展

黃建芳，王彩霞，向軍儉*，鄭 函

（暨南大學 廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣東 廣州 510632）

食物過敏是食品安全的重要問題之一，日益受到人們的關注。食物過敏動物模型不僅為食物過敏機制的研究提供重要的依據，而且還可有效地對食物過敏原進行準確的評價和檢測。本文對小鼠、大鼠、豚鼠等嚙齒類動物及幼豬和狗等非嚙齒類常見食物過敏動物模型、動物模型致敏途徑以及動物過敏模型檢測、評價指標等研究進行了綜述。

食物過敏；動物模型；過敏原檢測；致敏性評價

食物過敏屬于食品安全領域，約6%～8%的兒童和2%～4%的成人受到食物過敏的影響，并呈不斷增加的趨勢[1]。食物過敏多為IgE介導的I型超敏反應：當食物過敏原進入機體后，激活Th2細胞并分泌白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、白細胞介素5（interleukin 5，IL-5）、白細胞介素4（interleukin 13，IL-13）等細胞因子，誘發B細胞產生IgE抗體，IgE與靶細胞（肥大細胞，嗜堿性粒細胞）結合，使機體處于致敏狀態。當相應食物過敏原再次進入機體，與靶細胞上的IgE分子結合介導橋聯反應，激活下游信號通路，促使靶細胞脫顆粒，釋放如組胺、5-羥色胺、白三烯等介質，引起過敏反應[2]。目前被國際免疫學會認定的過敏食物有100多種，但90%的食物過敏反應由牛奶、雞蛋、魚、甲殼類、花生、大豆、小麥和堅果8類食物引起的[3]。

研究表明，嚙齒動物在免疫調節的許多方面與人類相似，如Th1和Th2細胞的分化和IgE介導的過敏反應等，且某些品系是高IgE反應型，類似人類的遺傳性過敏癥；而豬、狗等非嚙齒動物的胃腸解剖學和生理學、營養需求、黏膜免疫學等方面都與人類是相似的，具有天然的食物過敏反應，且食物過敏的發生率，胃腸道和皮膚的過敏臨床癥狀也與人類相似[4]。在多數情況下，引起人類過敏的食物可導致 某些動物過敏，因此可以通過建立敏感動物的食物過敏原模型，研究實驗動物對過敏原免疫應答的特異性與敏感性，為評價和檢驗檢測過敏原提供依據。

目前，食物過敏動物模型主要用于評價新型食物或蛋白的潛在致敏性，尤其是轉基因食品[5]，在2001年聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization，FAO）/世界衛生組織（World Health Organization，WHO）生物技術食品致敏性聯合專家咨詢會議制定的蛋白致敏性樹狀分析法中，動物模型實驗是其重要組成部分，也是最直接的方法[6]，它既避免了人體實驗的安全與倫理顧慮，又克服了體外實驗只能局部反映過敏原的性質，不能直接顯示其與機體作用結果的缺陷，可直接、準確的反應食物中的過敏原，是一種可靠的過敏原檢測與評價技術。此外食物過敏動物模型研究對于理解食物過敏反應復雜的免疫學和病理學機制具有重要作用，并可以運用其檢驗新的治療方法，評價低過敏食物或抗過敏食物的功效，以及研究食品加工過程和食品添加劑對食物潛在致敏性的影響[7]。

1 常用的食物過敏動物模型

在20世紀90年代，歐美一些國家就開展了食物過敏動物模型的研究。過敏動物模型主要可以分為嚙齒類動物（BALB/c、C57BL/6、A/J、BDF-1、C3H/HeJ等小鼠和BN等大鼠）和非嚙齒類動物（如狗和幼豬）。

1.1 小鼠模型

小鼠是最常用的動物模型，這主要是因為小鼠體積小，易于繁殖，實驗成本低，并已開發了多種小鼠免疫分子試劑及近親交配和轉基因的小鼠，小鼠模型已廣泛用于各種IgE介導的過敏性疾病的分子和細胞機制研究[7]。

BALB/c小鼠是常用的過敏動物模型，它是近交高IgE 應答品系。Dearman等[8-11]對BALB/c小鼠腹腔無佐劑注射模型進行了一系列研究：用過敏原花生凝集素、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）以及非過敏原馬鈴薯酸性磷酸酶（potato acid phosphatase，PAP）或馬鈴薯凝集素腹腔注射BALB/c小鼠，運用酶聯免疫和被動皮膚致敏試驗（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）分別檢測小鼠血清中的特異性IgG和IgE，結果顯示，BALB/c小鼠對花生凝集素、OVA和BSA產生了特異性IgG和IgE，而對PAP只產生特異性IgG而無IgE產生；另外，Adel-Patient等[12]和Lisa等[13]以霍亂毒素（cholera toxin ，CT）為佐劑口服致敏BALB/c小鼠，發現花生和牛奶蛋白致敏的小鼠能產生高的特異性IgE和IgG1，IL-4和IL-5分泌也相應增加，并伴隨局部的過敏癥狀；這些研究表明BALB/c小鼠可能是一種有效的食物過敏動物模型。

C3H/HeJ小鼠是高IgE應答品系和Toll樣受體4基因突變型。Li Xiumin等[14]以加入CT佐劑的花生粉末灌胃致敏C3H/HeJ小鼠。結果顯示，C3H/HeJ小鼠能產生針對花生粗提液及其主要過敏原Ara h1、Ara h2的特異性IgE，且與過敏患者IgE識別相同的Ara h2亞型和相似的過敏原表位及過敏原優勢表位；另外，致敏的C3H/HeJ小鼠在過敏原激發后產生明顯的與人類相似的過敏臨床癥狀。孫拿拿等[15]用灌胃及腹腔注射兩種途徑給予C3H/HeJ小鼠OVA，兩組小鼠均產生了OVA特異性IgE，熒光實時定量PCR檢測顯示脾細胞中IL-4 的表達顯著升高，而IFN-γ的表達則顯著降低。這些研究表明，C3H/HeJ小鼠是一種可靠有效的食物過敏動物模型。

C57/BL6小鼠是常用的過敏動物模型，多見于呼吸性過敏反應的研究。劉婉瑩等[16]用牛奶和蝦的粗提液皮下注射C57/BL6小鼠，以Al(OH)3作為佐劑，收集小鼠腹腔致敏肥大細胞（sensitivity of mast cell induced peritoneal，PMC），用牛奶、蝦過敏原體外誘導PMC釋放組胺，結果顯示致敏小鼠過敏原激發后產生較明顯的過敏癥狀，且PMC體外組胺釋放量與激發過敏原的來源、種類及劑量存在相關性。TNO Quality of Life實驗室研究小鼠的花生腹腔注射模型時，發現C57/BL6小鼠PCA陽性率較高，且可以產生較強的過敏癥狀[17]。因此，C57/BL6小鼠也是一種較好的食物過敏動物模型。

然而，不同品系的小鼠對同一食物過敏原識別模式和過敏的敏感性存在差異，不同食物對同一品系小鼠的致敏性和致敏率也存在差異，如TNO Quality of Life實驗室用花生的3個主要過敏原Ara h1、Ara h2和Ara h3分別致敏BALB/c、C3H/HeJ、A/J、C57BL/6小鼠，特異性IgE的檢測發現C3H/HeJ和A/J都能識別這3個過敏原，而BALB/c和 C57/BL6只能識別Ara h3[17]。因此，單一的小鼠過敏模型檢測和評價食物過敏原具有風險性，需要根據研究目的和研究對象合理選擇多種小鼠品系。

1.2 大鼠模型

大鼠作為食物過敏動物模型，具有以下優勢：它的大小適于在單個動物上進行血清特異性抗體的動力學分析，可以口服致敏且無需佐劑，致敏大鼠激發后可產生與人類相似的過敏癥狀[7]。BN大鼠是高免疫球蛋白（尤其是IgE）應答品系，已作為過敏動物模型被廣泛研究。

Knippels等[18]先后對BN大鼠的OVA致敏模型進行了深入研究，包括注射劑量、喂食模式、喂食頻率、飲食控制以及檢測指標等。實驗中連續42 d口服給予BN大鼠OVA（1 mg/d），且不使用佐劑。 酶聯免疫和PCA測定結果顯示，超過80%BN大鼠產生OVA特異IgE，且致敏小鼠OVA激發后腸通透性增加，少數動物的呼吸系統或血壓有微弱變化。TNO Quality of Life實驗室[17]運用純化的花生過敏原Ara h1、蝦過敏原Pena 1、馬鈴薯過敏原Sol t1（罕見過敏原）和牛肉原肌球蛋白（非過敏原），以口服無佐劑、口服加佐劑和腹腔無佐劑3種途徑致敏BN大鼠，結果顯示口服致敏的BN大鼠產生了過敏原特異性IgE和IgG2a，佐劑不會增加模型的敏感度，另外酶聯免疫檢測出BN大鼠IgE陽性反應率排序為Ara h1＞Pen a 1＞Sol t 1，牛肉原肌球蛋白則無致敏性，這與人群中這幾種過敏原的致敏率相似。Bogh 等[19]研究也發現BN大鼠識別花生主要過敏原Ara h1的IgE表位與人類相同。人群中不同過敏原的發病率和致敏強度具有差異，理想的動物模型應該能反映人群中不同過敏原的致敏率以及人類對不同過敏原的反應強度，因此BN大鼠是一種理想的過敏動物模型。呂相征[20]、向錢[21]、李中港[22]等的研究也證實了BN大鼠是一種較理想的口服致敏動物模型。

1.3 豚鼠模型

豚鼠具有易感性，是最普遍的過敏動物模型之一。Devey等[23]通過口服方式致敏豚鼠，結果發現，致敏后豚鼠以注射、口服方式再次接觸全牛奶或其主要過敏原酪蛋白、α-乳清蛋白會發生死亡或產生應激性休克，表明豚鼠具有與人相似的致敏途徑，是一種良好的牛奶過敏動物模型。王麗娟等[24]用0.1～20 mg/mL卵白蛋白和蝦蛋白致敏并激發豚鼠，結果顯示100%豚鼠呈全身過敏反應，1 mg/mL卵白蛋白激發組的豚鼠全部死亡，蝦蛋白對致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮反應（Schultz-Dale反應）的影響與全身過敏反應結果相似，表明豚鼠是蝦和卵白蛋白的一種合適的過敏模型。向軍儉等[25]用海蝦粗提液和Al(OH)3佐劑混合免疫致敏豚鼠，發現豚鼠的血清中海蝦蛋白及其主要過敏原Pen a1的血清IgE和IgG水平顯著提高，表明豚鼠具有跟人類相似的過敏原識別機制，是一種較好的過敏動物模型。

1.4 幼豬和狗模型

在蛋白質致敏性的研究中，幼豬和狗等非嚙齒類動物不是常用的動物模型。Twuber等[26]建立了狗的花生和樹堅果過敏動物模型，致敏的狗對相應的過敏原皮膚試驗陽性，產生了特異性的IgE，且口服激發后出現嘔吐和嗜睡的癥狀。Ermel等[27]用口服和皮下注射的途徑建立了辛巴吉犬過敏動物模型的種系，致敏的辛巴吉犬能對一系列食物過敏原和過敏食物發生過敏反應，產生特異性的IgE，出現明顯的過敏臨床癥狀如反胃、惡心、腹瀉和紅斑，胃腸血管的通透性增強，血壓升高等。Helm等[28]通過腹腔注射花生蛋白使懷孕的蘭德瑞斯豬致敏，結果大部分幼豬口服激發和PCA實驗陽性，并產生了嚴重的胃腸黏膜損傷，出現嘔吐、腹瀉和呼吸困難等癥狀。黃瓊等[29]用11 S大豆過敏蛋白，也發現大豆抗原蛋白11 S可誘發五指山小型豬產生IgE介導的Ⅰ型過敏反應。雖然幼豬和狗具有與人類非常相似的過敏反應，但是致敏周期長、致敏劑量大、體積大、實驗成本高，且缺乏相關的分子免疫試劑，因此它們更多是用于過敏機制研究而非致敏性評價[20]。

2 致敏方式選擇

過敏動物模型中，致敏方式取決于動物種類與過敏原分子的易感性和特異性。過敏原的性質、免疫劑量、給予頻率和途徑[30]均可影響免疫反應的方向（致敏或耐受）。除了蛋白質本身的致敏性外，食物介質（脂質、糖類、其他蛋白等）和食物中的污染物（脂多糖、內毒素、凝集素等）也會影響蛋白質的免疫原性和過敏原性[31]，Dearman等[32]的研究發現內源的脂類對于巴西堅果主要過敏原Ber e1的致敏性是必需的，并且加入不同的脂類可誘導不同的IgE反應。表1具體介紹了3種主要致敏途徑的致敏劑量、周期和優缺點。針對不同的動物模型，致敏方式也應發生相應的變化，一般需選擇多種途徑進行組合和比較論證，從而獲得最佳的方式。

表1 致敏方式（嚙齒動物）Table 1 Sensitization routes (rodent)

3 檢測指標

Ⅰ型過敏癥的檢測指標有多種，但過敏反應的機制是復雜的，單一的指標并不能反應機體的過敏狀態，實際中需聯合多種指標進行檢測，以下是常用的幾種檢測指標。

3.1 過敏原特異性抗體

血清IgE是最常用的檢測指標。IgE的檢測方法包括酶聯免疫、Western blotting以及基于其生物活性的實驗如PCA或大鼠嗜堿性粒細胞（rat basophilic leukemia cell line 2H3， RBL-2H3）脫顆粒實驗。酶聯免疫是檢測血清中的特異性IgE最常用的方法，但易受IgG的干擾。實際中，大多數研究者在對蛋白進行地高辛或生物素標記后，利用夾心酶聯免疫檢測，或者在間接酶聯免疫檢測之前去除血清中的IgG[31]。Western blotting方法主要用于鑒定復雜混合物中IgE特異性蛋白組分。PCA常用于嚙齒動物模型中，可以反映結合到肥大細胞表面的具有生物活性的IgE含量。

小鼠的IgG1、大鼠和豚鼠的IgG2a與遲發型過敏反應相關，也屬于Th2型抗體，受Th2型細胞因子的調節，因此也常作為過敏檢測指標。蛋白特異性的IgG1或IgG2a常用間接酶聯免疫檢測。但是只有在特定的實驗體系中，用IgG亞型抗體作為IgE的替代指標才是合適的，在一些情況下，IgG1和IgE的產生不具有相關性[31]。Dearman等[7]研究發現小鼠中存在兩種IgG1抗體：一種IL-4依賴的IgG1抗體，它誘導肥大細胞脫顆粒；一種非IL-4依賴的IgG1抗體，它受γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和IL-12調節，不產生PCA反應。Gizzarrelli[33]和Birmingham[34]等也發現在大豆或榛子致敏的BALB/C小鼠中，血清中的IgG1和IgE水平均顯著升高，但同時IgG2a（Th1型抗體）的水平也升高，只是比IgG1和IgE增高的水平要低，而且在C3H/HeJ小鼠的口服花生致敏模型lgA的水平也升高，說明在動物模型中過敏反應可能是由多種特異性抗體參與的反應[36]。

3.2 免疫細胞和細胞因子

Th2細胞和CD4+CD25+調節性T細胞（T Reg）在過敏反應的致敏和激發階段都發揮著重要作用。TH2細胞通過分泌一些細胞因子誘導IgE的產生，引起過敏反應，主要Th2細胞因子有IL-4、IL-5、IL-13等[2,36]。此外Th1細胞分泌IFN-γ抑制IgE的產生，而CD4+CD25+調節性T細胞通過分泌免疫抑制性的細胞因子IL-10控制過敏反應[7]。Zhang Songguo等[37]發現OVA誘導OVA TCR轉基因小鼠產生口服耐受后CD4+CD25+T Reg增加，將已產生口服耐受小鼠的CD4+CD25+T Reg轉移到BALB/c中能抑制小鼠發生遲發型過敏反應，而IL-10受體和TGF-β受體可以部分抑制CD4+CD25+T Reg發揮作用。

在過敏動物模型中，脾細胞增殖反應和相關細胞因子分析作為血清分析的補充是非常有用的檢測指標[33]。van Wijk等[36]研究的C3H/HeJ小鼠的口服花生致敏模型中，分別取花生致敏小鼠在致敏早期（第8天）和晚期（第49天）的脾臟進行體外培養，再分別加入花生粗提液、Ara h1、Ara h2 Ara h3、Ara h6進行共培養刺激，用酶聯免疫試劑盒檢測培養上清中IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ的含量，結果表明在致敏早期和晚期，與對照相比過敏原刺激的脾細胞培養上清中4種細胞因子的含量均升高，且有劑量依賴性。Morafo等[38]研究C3H/HeJ小鼠口服牛奶致敏模型也得到類似的結果，即IL-4、IL-10和IFN-γ的水平都明顯升高。在BALB/c小鼠和BN大鼠的過敏模型中Th1型細胞因子和Th2型細胞因子也均升高。在Ⅰ型超敏反應中，例如哮喘和食物過敏，通常認為Th1/Th2平衡向Th2偏移是產生過敏的關鍵因素，但是目前關于哮喘的研究表明這一假設太過簡單[39]，在花生過敏患者中觀察到多種亞型的花生特異的抗體反應，包括血清中IgG1、IgG4、lgA水平的升高[40]，此外食物過敏患者身上也觀察到Th1/Th2混合的細胞因子反應[41]。而過敏動物模型的研究也表明，在實驗動物中過敏反應也并不是嚴格由Th2反應介導，可能是一個Th1/Th2混合的反應[42-43]。

3.3 臨床癥狀

致敏動物激發后的臨床癥狀也可以作為檢測指標。觀察過敏原激發后的全身性過敏癥狀如浮腫、腹瀉、氣喘、驚厥、死亡等，在小鼠模型中根據癥狀嚴重程度被分為6個等級，從而實現定量檢測[14]。而動物的局部過敏反應如：呼吸頻率增加、胃腸通透性增加、直腸溫度下降、胃腸道病理損傷等癥狀都可通過相應的試劑儀器或組織學觀察進行檢測[33-44]。耳部膨脹實驗和皮膚試驗也常用于檢測動物過敏反應[34]。

3.4 活性介質和其他指標

Ⅰ型過敏反應最重要的特征是過敏原激發后肥大細胞脫顆粒釋放活性介質引起過敏反應，常用的檢測肥大細胞脫顆粒的活性介質有組胺、類胰蛋白酶、β-己糖胺酶、小鼠肥大細胞蛋白酶1（mouse mast cell protease、mMCP-1），可通過酶聯免疫或酶活力測定進行檢測[35-36,45]。其中組胺是經典的過敏介質，本實驗室不僅在國內率先建立組胺熒光檢測方法，而且還建立了致敏肥大細胞體外定向釋放組胺的模型[16]，但是由于組胺的半衰期很短，其他蛋白類的過敏介質越來越受到重視。Th2細胞和靶細胞活化相關的細胞表面分子或特異轉錄因子GATA-3表達量的多少也是有效的檢測指標[31,34,46]。

4 結 語

4.1 模型的綜合因素

過敏動物模型的建立、評價和優化需要考慮到眾多的因素，過敏原的性質和動物的種類可能是兩個最重要的方面。人類的過敏反應具有個體性、地區性和年齡差別，不同的過敏原對同一個體的致敏性不同，而不同個體對同一過敏原的過敏反應也不相同，因此對于動物模型，不同的過敏原可能適用于不同的動物種類，過敏原的性質、純度以及與其他過敏原的交叉反應都將影響動物的過敏反應[47]。目前已研究開發了多種動物模型，選擇時需要考慮不同種屬動物的免疫反應特點，使用一個模型動物的成本和合理性（動物的大小、飼養、操作），以及是否有相關的分析試劑。過敏原性質和不同種屬動物免疫應答的特點基本決定了免疫途徑（最好口服）[48]、免疫劑量、免疫周期和佐劑的使用。過敏的檢測指標有多種，不同種屬的動物可能適用于不同的檢測指標，可針對不同的動物種類選擇最佳的定性和定量檢測指標。總之，應根據不同的研究目的，將不同因素進行綜合考慮和分析，以得到最佳的動物模型。

4.2 存在的問題

動物過敏模型由于能直接、準確的反應食物中的過敏原，隨著近年來一些較為理想的動物模型逐漸被研究開發，動物過敏模型作為一種評價和鑒定食物過敏原的有效途徑受到廣泛關注。但現有的動物模型也存在一定的局限性，如重復性較差，對于同一模型不同的研究者得到的結果差異較大，如呂相征等[49]研究BALB/c小鼠的腹腔注射模型時，發現小鼠對過敏原和非過敏原都產生特異性IgE，表明BALB/c小鼠并非理想的食物過敏動物模型，因此動物模型的建立應實現過敏原，致敏過程和檢測指標的標準化，從而建立可靠的動物模型。目前沒有一個動物模型對大范圍的過敏原和非過敏原進行了檢測和驗證，因此還不能運用于檢測和評價，但目前的研究表明正確應用動物模型，并結合其他的評價標準，可以有效地對食品的致敏性進行準確的檢測和評價。

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Research Advances in Animal Models of Food Allergy

HUANG Jian-fang, WANG Cai-xia, XIANG Jun-jian*, ZHENG Han
(Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Food allergy is an important food safety issue, and has received more attention recently. Animal models of food allergy are not only necessary to pursue the mechanisms and potential treatments of food allergy, but also become a useful approach to accurate identification and assessment of food allergens. Common animal models of food allergy and their allergic pathways, biological detection methods and allergenicity evaluation are reviewed in this paper.

food allergy; animal model; allergen detection; allergenicity assessment

R392.8

A

1002-6630（2014）03-0280-05

10.7506/spkx1002-6630-201403055

2013-02-20

廣東省重點實驗室建設項目（2011A060901017）

黃建芳（1984—），女，碩士，研究方向為食物過敏原。E-mail：jianfang_514@163.com

*通信作者：向軍儉（1952—），男，教授，碩士，研究方向為抗體藥物及食品安全。E-mail：txjj@jnu.edu.cn