壬基酚致NCTC1469細(xì)胞的損傷作用及活性氧水平、谷胱甘肽含量變化

陳泱杰，劉曉珍，黃丹菲，謝明勇*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

壬基酚致NCTC1469細(xì)胞的損傷作用及活性氧水平、谷胱甘肽含量變化

陳泱杰，劉曉珍，黃丹菲，謝明勇*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：探究壬基酚對NCTC1469細(xì)胞的損傷作用及細(xì)胞內(nèi)活性氧類、還原型谷胱甘肽含量的影響。方法：通過體外細(xì)胞實驗，用不同質(zhì)量濃度壬基酚作用NCTC1469細(xì)胞24 h；CCK-8法檢測細(xì)胞存活率；測定藥物作用后培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草 轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）活性及細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧類水平。結(jié)果：壬基酚可顯著抑制NCTC1469細(xì)胞增殖及促進(jìn)活性氧類生成（P＜0.05），呈一定劑量依賴性；培養(yǎng)液上清液中LDH、ALT活性在壬基酚濃度大于0.1 μmol/L處理組中，與自然釋放對照組相比顯著升高（P＜0.05）；且壬基酚在高劑量（1、10、100 μmol/L）能明顯增加培養(yǎng)液上清中AST活性（P＜0.01）；壬基酚呈劑量依賴性降低細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量，與空白對照組比較有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論：推測壬基酚可能通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧類水平，下調(diào)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對NCTC1469細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。

壬基酚；NCTC1469細(xì)胞；氧化應(yīng)激

壬基酚（nonylphenol，NP）是一種烷基酚類化合物，被廣泛用作乳化劑、增塑劑、洗滌劑等，并大量用于生產(chǎn)食品包裝材料、黏合劑等。由于NP在環(huán)境中狀態(tài)較為穩(wěn)定，難以降解，因此可通過食物鏈進(jìn)入人體[1]。此外，Inoue等[2]發(fā)現(xiàn)NP在長期與食品接觸以及微波加熱食品的過程中，可由食品包裝袋遷移至食品中，從而進(jìn)入人體。Geuenther等[3]更證實了在大部分日常零售食品中可檢測出較高含量的NP，并推測NP普遍存在于人們?nèi)粘Ｋ秤玫氖澄镏小?/p>

研究表明，NP的化學(xué)結(jié)構(gòu)與動物及人類的雌性激素酷似，進(jìn)入生物體內(nèi)可引起內(nèi)分泌紊亂，屬于內(nèi)分泌干擾物[4]。不少學(xué)者認(rèn)為，NP不僅具有內(nèi)分泌干擾作用，而且在環(huán)境相關(guān)濃度下，對機體多種器官亦具有高度毒性作用，很可能是一種全身性多臟器的毒性物質(zhì)[5-8]。目前，國內(nèi)外關(guān)于NP對生物體生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的組織損傷作用已出現(xiàn)較多報道[9-10]。但在體外條件下，利用肝細(xì)胞模型研究NP對肝細(xì)胞的影響較少。因此，本實驗旨在以NCTC1469小鼠肝細(xì)胞為毒理學(xué)模型，將其暴露于不同質(zhì)量濃度的NP后，通過測定細(xì)胞存活率以及培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）的活性，探究壬基酚對肝細(xì)胞的損傷程度。同時應(yīng)用熒光探針探測壬基酚引起的肝細(xì)胞內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species，ROS）的生成并觀察細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的變化，初步探討壬基酚對肝細(xì)胞的損傷機理，并為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NP（純度99%以上：溶于乙醇，配制成母液） 美國Sigma公司；NCTC1469細(xì)胞 美國菌種保藏中心；無酚紅DMEM培養(yǎng)基、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清 美國Hyclone公司；0.25%胰酶 北京索萊寶公司；2’,7’-二氯乙酰乙酸鹽熒光素 丹麥 DAKO 公司；CCK-8試劑盒日本同仁化學(xué)研究所；LDH、ALT、AST、GSH測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞儀 美國BD公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；超凈工作臺 上海一恒科技有限公司；冷凍高速離心機美國Sigma公司；多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；超低溫冰箱 青島海爾電冰箱股份有限公司；Milli-Q50超純水凈化系統(tǒng) 美國Millipore公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NCTC1469細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，1～2 d換液，選用對數(shù)生長期良好的細(xì)胞進(jìn)行傳代或后續(xù)實驗處理。傳代時棄原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，1 000 r/min離心5 min后加入新培養(yǎng)液，重懸，接種于新培養(yǎng)瓶。

1.3.2 CCK-8法測定細(xì)胞存活率

NCTC1469細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL，按每孔100 ?L接種于96孔板中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔分別加入10 ?L終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L 的NP溶液，同時設(shè)溶劑對照組（0.01%乙醇）和空白對照組（DMEM培養(yǎng)基不含細(xì)胞），每組設(shè)6個平行孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 ?L CCK-8試劑，置于搖床上搖勻，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，終止培養(yǎng)。選擇450 nm波長，在多功能酶標(biāo)儀上測定各孔OD值，記錄結(jié)果。根據(jù)下式計算細(xì)胞存活率。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、ALT、AST活性測定

NCTC1469細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL接種于96孔板中，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，加入200 ?L終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的NP溶液，同時設(shè)細(xì)胞自然釋放對照組（DMEM培養(yǎng)基），每組各設(shè)6個復(fù)孔。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別吸取各孔培養(yǎng)液上清100 ?L，按照試劑盒說明書測定LDH、ALT、AST活性。

1.3.4 ROS水平檢測

NCTC1469細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，加入2 mL終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的NP溶液，同時設(shè)置空白對照組（DMEM培養(yǎng)基）。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24h，分別吸去培養(yǎng)液，每孔加入1mL終濃度為10μmol/L的2’,7’-二氯乙酰乙酸鹽熒光素，37 ℃避光孵育30 min后收集細(xì)胞，磷酸緩沖液洗兩次，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，每次計數(shù)1×104個細(xì)胞，用 Cell Quest 軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)GSH含量的測定

NCTC1469細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，加入2 mL終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的NP溶液，同時設(shè)置空白對照組（DMEM培養(yǎng)基）。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清，加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的偏磷酸緩沖液充分混懸，利用液氮和37 ℃水浴對樣品進(jìn)行3次快速的凍融，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書測定GSH含量。用Bradford法測定細(xì)胞蛋白水平校正細(xì)胞內(nèi)GSH含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NP對NCTC1469細(xì)胞存活率的影響

圖1 NP對NCTC1469細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of NP on the survival rate of NCTC1469 cells

如圖1所示，NP在終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L時作用于NCTC1469細(xì)胞24 h后，可抑制細(xì)胞增殖，且呈一定的劑量相關(guān)性。結(jié)果表明，NP濃度在高于10 μmol/L時，對NCTC1469細(xì)胞具有顯著生長抑制作用。

2.2 NP對NCTC1469細(xì)胞LDH、ALT、AST滲透量的影響

表1 各組培養(yǎng)上清液中LDH、AST、ALT的活性Table 1 Effect of NP on LDH, AST and ALT activities in culture supernatant of NCTC1469 cells (x ±s，n==66))

表1 各組培養(yǎng)上清液中LDH、AST、ALT的活性Table 1 Effect of NP on LDH, AST and ALT activities in culture supernatant of NCTC1469 cells (x ±s，n==66))

注：*.與自然釋放對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與自然釋放對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

組別 劑量/（μmol/L） LDH活力/（U/L） ALT活力/（U/L） AST活力/（U/L）自然釋放對照組 478.46±1.15 15.83±2.34 27.13±1.43 0.01 499.82±1.36 20.59±1.64 27.56±1.07 0.1 651.70±2.63* 58.27±2.94** 44.66±3.59 NP濃度 1 867.77±1.14** 71.02±1.83** 91.77±8.2** 10 873.69±2.34** 91.38±1.42** 118.85±7.35** 100 1 024.06±2.05** 158.14±4.68** 226.72±6.62**

由表1可知，各給藥組上清液中LDH、ALT、AST活性高于自然釋放對照組，且當(dāng)NP濃度高于0.1 μmol/L時，上清液中LDH、ALT活性與自然釋放對照組相比具有顯著性差異，當(dāng)NP濃度高于1 μmol/L時，上清液中AST活性與自然釋放對照組相比具有顯著性差異。結(jié)果說明，NP可增加NCTC1469細(xì)胞LDH、ALT、AST的滲透量，且呈一定的劑量依賴性。

2.3 NP對NCTC1469細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

為了檢測NP是否影響NCTC1469細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用不同濃度NP（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）作用NCTC1469細(xì)胞24 h后，利用DCFH-DA熒光探針標(biāo)記，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS生成。如圖2所示，經(jīng)NP刺激后，NCTC1469細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升。由圖3可知，藥物作用組ROS水平與空白對照組相比具有顯著差異性，并呈劑量依賴性。

圖2 NP對NCTC1469細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.2 Flow cytometer analysis of the effect of NP on ROS level in NCTC1469 cells

圖3 NP對NCTC1469細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 3 Effect of NP on ROS level in NCTC1469 cells

2.4 NP對NCTC1469細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響

圖4 NP對NCTC1469細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響Fig.4 Effect of NP on GSH level in NCTC1469 cells

收集NP作用后的NCTC1469細(xì)胞，測定胞內(nèi)GSH含量，利用細(xì)胞蛋白含量校正。由圖4可見，NP刺激NCTC1469細(xì)胞后，與空白對照組相比，各藥物組胞內(nèi)GSH含量顯著降低，且呈一定的濃度劑量依賴性。

3 討 論

目前，NP對人類健康的潛在危害已引起廣大研究者關(guān)注。由于其是內(nèi)分泌干擾物的典型代表，因此可對機體內(nèi)分泌系統(tǒng)造成損害。然而在評估NP對機體的危害時，應(yīng)綜合考慮其對整體的損傷作用。研究表明，母體暴露NP可引起幼鼠肝組織病變[11]，成年大鼠經(jīng)消化道染毒的亞慢性實驗結(jié)果也顯示肝、腎可能是NP作用的主要靶器官[12]。郭彤等[13]以鯽肝細(xì)胞作為毒理學(xué)模型發(fā)現(xiàn)當(dāng)鯽肝細(xì)胞暴露于一定濃度范圍的壬基酚（＞0.1 μmol/L）環(huán)境下，在24 h內(nèi)能明顯抑制肝細(xì)胞增殖，并隨NP濃度的增加，抑制作用顯著增強。本實驗利用CCK-8法檢測NP對NCTC1469細(xì)胞存活率的影響，CCK-8分析法的原理是基于WST-8可被線粒體中的脫氫酶還原成水溶性的橙黃色甲臜染料，且生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。由本實驗結(jié)果可知，NP作用24 h后可抑制細(xì)胞增殖，并隨著藥物濃度增加，抑制效果愈加明顯，當(dāng)NP濃度大于10 μmol/L時，其對NCTC1469細(xì)胞的生長抑制作用具有顯著性，推測肝細(xì)胞線粒體在高濃度NP作用下受到較大損傷。

體外肝細(xì)胞培養(yǎng)是一種簡便快速的體外毒理學(xué)實驗系統(tǒng)[14]。LDH是肝細(xì)胞內(nèi)一種重要的酶，可催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)機體正常生理活動，在正常情況下不會透過細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受到損傷或毒害，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，LDH就會釋放到介質(zhì)中去[15]。ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，當(dāng)肝細(xì)胞損傷使膜通透性改變，導(dǎo)致介質(zhì)中ALT活力明顯升高；AST主要分布在肝細(xì)胞的線粒體中，其余存在于胞漿，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時，肝細(xì)胞線粒體進(jìn)一步遭到破壞，大量AST釋放，使介質(zhì)中AST活力明顯升高[16]。因此，肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH、ALT、AST漏出量是評價肝細(xì)胞受損的敏感指標(biāo)。本實驗表明，各濃度NP作用NCTC1469細(xì)胞后，各給藥組上清液中LDH、ALT、AST活性高于自然釋放組，當(dāng)NP濃度高于1 μmol/L時，上清液中LDH、ALT、AST活性與自然釋放對照組相比具有顯著性差異，且呈一定的劑量依賴性。其中，AST升高幅度高于ALT，提示肝細(xì)胞線粒體破壞，表明NP對NCTC1469細(xì)胞具有較強的損傷作用，破壞肝細(xì)胞生長微環(huán)境，引起膜通透性異常增大。

污染物在生物體內(nèi)代謝過程中可進(jìn)行氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生大量的ROS，這些ROS可引發(fā)機體氧化應(yīng)激，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的毒性效應(yīng)[17-19]。相關(guān)研究表明，NP可使細(xì)胞內(nèi)ROS增加，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。氧化應(yīng)激不僅可由細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多而造成，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)減少同樣可引起氧化應(yīng)激。GSH是主要的細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)參與氨基酸轉(zhuǎn)運，拮抗外源性毒物，修復(fù)氧自由基損傷，調(diào)節(jié)機體免疫功能以及維持細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮著重要作用[21]。本實驗測定了NP作用后細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH水平，結(jié)果顯示，NP刺激NCTC1469細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平與空白對照組相比顯著升高，并與NP作用濃度呈正相關(guān)。相反，NP作用后細(xì)胞內(nèi)GSH含量與空白對照組相比顯著降低，且呈一定劑量依賴性。提示NP可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成，減少細(xì)胞內(nèi)GSH含量，從而誘導(dǎo)NCTC1469細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

總之，上述研究結(jié)果表明，小鼠肝細(xì)胞NCTC1469暴露于NP環(huán)境下時，使肝細(xì)胞增殖明顯降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、ALT、AST滲出量明顯增加，表明一定濃度的NP對肝細(xì)胞具有損傷作用。同時，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，且胞內(nèi)GSH含量顯著降低，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧類產(chǎn)生過多超過抗氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡而對細(xì)胞造成損害。由此可以推測NP引起NCTC1469細(xì)胞的氧化應(yīng)激效應(yīng)可能是導(dǎo)致其毒性作用的機制之一。但NP究竟是如何通過細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對細(xì)胞造成損傷還需要做進(jìn)一步的研究，因此大量的研究工作有待于今后繼續(xù)進(jìn)行。

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Nonylphenol Induces Injury and Variations in ROS and GSH Content of NCTC1469 Cells

CHEN Yang-jie, LIU Xiao-zhen, HUANG Dan-fei, XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective：To explore the effect of nonylphenol (NP) on inducing injury and changing ROS and GSH contents in NCTC1469 cells. Methods: Cultured cells were treated with NP (0, 0. 01, 0.1, 1, 10 μmol/L and 100 μmol/L) for 24 h. Then, cell viability was assessed with a cell counting kit; the NP-induced injury was evaluated by detecting lactate dehydrogenase (LDH), alanine aminotransamine (ALT) and aspartate aminotransaminase (AST) activities in cell culture supernatant and the contents of intracellular glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) were assayed by flow cytometric method. Results: NP could inhibit NCTC1469 cell proliferation and promote ROS generation significantly in a dose-dependent manner. Compared with the control group, the LDH and ALT activities in cell culture supernatant from 0.1–100 μmol/L NP groups had a significant increase, while the AST activity increased dramatically only in 1–100 μmol/L NP groups. NP could decrease intracellular GSH content in a dose-dependent manner, and there was a significant difference when compared with the control group. Conclusion: NP can induce NCTC1469 cells injury by up-regulating the level of ROS and downregulating the content of GSH.

nonylphenol; NCTC1469 cells; oxidative stress

Q291

A

1002-6630（2014）03-0198-05

10.7506/spkx1002-6630-201403040

2013-10-10

國家“973”計劃項目 （2012CB720805）；科技部國際合作項目（2010DFA31780）；國家基金委中德科學(xué)基金中心合作項目（GZ731）

陳泱杰（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：chenyangjie0914@126.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)、食品營養(yǎng)與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn