壬基酚致NCTC1469細胞的損傷作用及活性氧水平、谷胱甘肽含量變化

陳泱杰，劉曉珍，黃丹菲，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

壬基酚致NCTC1469細胞的損傷作用及活性氧水平、谷胱甘肽含量變化

陳泱杰，劉曉珍，黃丹菲，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：探究壬基酚對NCTC1469細胞的損傷作用及細胞內(nèi)活性氧類、還原型谷胱甘肽含量的影響。方法：通過體外細胞實驗，用不同質(zhì)量濃度壬基酚作用NCTC1469細胞24 h；CCK-8法檢測細胞存活率；測定藥物作用后培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草 轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）活性及細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量；流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧類水平。結(jié)果：壬基酚可顯著抑制NCTC1469細胞增殖及促進活性氧類生成（P＜0.05），呈一定劑量依賴性；培養(yǎng)液上清液中LDH、ALT活性在壬基酚濃度大于0.1 μmol/L處理組中，與自然釋放對照組相比顯著升高（P＜0.05）；且壬基酚在高劑量（1、10、100 μmol/L）能明顯增加培養(yǎng)液上清中AST活性（P＜0.01）；壬基酚呈劑量依賴性降低細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量，與空白對照組比較有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論：推測壬基酚可能通過上調(diào)細胞內(nèi)活性氧類水平，下調(diào)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量，引起氧化應激反應，從而對NCTC1469細胞產(chǎn)生損傷作用。

壬基酚；NCTC1469細胞；氧化應激

壬基酚（nonylphenol，NP）是一種烷基酚類化合物，被廣泛用作乳化劑、增塑劑、洗滌劑等，并大量用于生產(chǎn)食品包裝材料、黏合劑等。由于NP在環(huán)境中狀態(tài)較為穩(wěn)定，難以降解，因此可通過食物鏈進入人體[1]。此外，Inoue等[2]發(fā)現(xiàn)NP在長期與食品接觸以及微波加熱食品的過程中，可由食品包裝袋遷移至食品中，從而進入人體。Geuenther等[3]更證實了在大部分日常零售食品中可檢測出較高含量的NP，并推測NP普遍存在于人們?nèi)粘Ｋ秤玫氖澄镏小?/p>

研究表明，NP的化學結(jié)構(gòu)與動物及人類的雌性激素酷似，進入生物體內(nèi)可引起內(nèi)分泌紊亂，屬于內(nèi)分泌干擾物[4]。不少學者認為，NP不僅具有內(nèi)分泌干擾作用，而且在環(huán)境相關濃度下，對機體多種器官亦具有高度毒性作用，很可能是一種全身性多臟器的毒性物質(zhì)[5-8]。目前，國內(nèi)外關于NP對生物體生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的組織損傷作用已出現(xiàn)較多報道[9-10]。但在體外條件下，利用肝細胞模型研究NP對肝細胞的影響較少。因此，本實驗旨在以NCTC1469小鼠肝細胞為毒理學模型，將其暴露于不同質(zhì)量濃度的NP后，通過測定細胞存活率以及培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）的活性，探究壬基酚對肝細胞的損傷程度。同時應用熒光探針探測壬基酚引起的肝細胞內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species，ROS）的生成并觀察細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的變化，初步探討壬基酚對肝細胞的損傷機理，并為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NP（純度99%以上：溶于乙醇，配制成母液） 美國Sigma公司；NCTC1469細胞 美國菌種保藏中心；無酚紅DMEM培養(yǎng)基、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清 美國Hyclone公司；0.25%胰酶 北京索萊寶公司；2’,7’-二氯乙酰乙酸鹽熒光素 丹麥 DAKO 公司；CCK-8試劑盒日本同仁化學研究所；LDH、ALT、AST、GSH測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

流式細胞儀 美國BD公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；超凈工作臺 上海一恒科技有限公司；冷凍高速離心機美國Sigma公司；多功能酶標儀 美國Thermo公司；超低溫冰箱 青島海爾電冰箱股份有限公司；Milli-Q50超純水凈化系統(tǒng) 美國Millipore公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

NCTC1469細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞貼壁生長，1～2 d換液，選用對數(shù)生長期良好的細胞進行傳代或后續(xù)實驗處理。傳代時棄原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌后用細胞刮將細胞刮下，1 000 r/min離心5 min后加入新培養(yǎng)液，重懸，接種于新培養(yǎng)瓶。

1.3.2 CCK-8法測定細胞存活率

NCTC1469細胞經(jīng)胰酶消化，調(diào)整細胞密度為1×105cells/mL，按每孔100 ?L接種于96孔板中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔分別加入10 ?L終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L 的NP溶液，同時設溶劑對照組（0.01%乙醇）和空白對照組（DMEM培養(yǎng)基不含細胞），每組設6個平行孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 ?L CCK-8試劑，置于搖床上搖勻，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，終止培養(yǎng)。選擇450 nm波長，在多功能酶標儀上測定各孔OD值，記錄結(jié)果。根據(jù)下式計算細胞存活率。

1.3.3 細胞培養(yǎng)上清液中LDH、ALT、AST活性測定

NCTC1469細胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1×105cells/mL接種于96孔板中，待細胞進入對數(shù)生長期時，加入200 ?L終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的NP溶液，同時設細胞自然釋放對照組（DMEM培養(yǎng)基），每組各設6個復孔。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別吸取各孔培養(yǎng)液上清100 ?L，按照試劑盒說明書測定LDH、ALT、AST活性。

1.3.4 ROS水平檢測

NCTC1469細胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1×105cells/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，待細胞進入對數(shù)生長期時，加入2 mL終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的NP溶液，同時設置空白對照組（DMEM培養(yǎng)基）。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24h，分別吸去培養(yǎng)液，每孔加入1mL終濃度為10μmol/L的2’,7’-二氯乙酰乙酸鹽熒光素，37 ℃避光孵育30 min后收集細胞，磷酸緩沖液洗兩次，立即用流式細胞儀進行檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，每次計數(shù)1×104個細胞，用 Cell Quest 軟件進行分析。

1.3.5 細胞內(nèi)GSH含量的測定

NCTC1469細胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1×105cells/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，待細胞進入對數(shù)生長期時，加入2 mL終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的NP溶液，同時設置空白對照組（DMEM培養(yǎng)基）。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，PBS洗滌細胞1次，離心收集細胞，吸盡上清，加入細胞沉淀體積3倍量的偏磷酸緩沖液充分混懸，利用液氮和37 ℃水浴對樣品進行3次快速的凍融，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書測定GSH含量。用Bradford法測定細胞蛋白水平校正細胞內(nèi)GSH含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NP對NCTC1469細胞存活率的影響

圖1 NP對NCTC1469細胞存活率的影響Fig.1 Effect of NP on the survival rate of NCTC1469 cells

如圖1所示，NP在終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L時作用于NCTC1469細胞24 h后，可抑制細胞增殖，且呈一定的劑量相關性。結(jié)果表明，NP濃度在高于10 μmol/L時，對NCTC1469細胞具有顯著生長抑制作用。

2.2 NP對NCTC1469細胞LDH、ALT、AST滲透量的影響

表1 各組培養(yǎng)上清液中LDH、AST、ALT的活性Table 1 Effect of NP on LDH, AST and ALT activities in culture supernatant of NCTC1469 cells (x ±s，n==66))

表1 各組培養(yǎng)上清液中LDH、AST、ALT的活性Table 1 Effect of NP on LDH, AST and ALT activities in culture supernatant of NCTC1469 cells (x ±s，n==66))

注：*.與自然釋放對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與自然釋放對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

組別 劑量/（μmol/L） LDH活力/（U/L） ALT活力/（U/L） AST活力/（U/L）自然釋放對照組 478.46±1.15 15.83±2.34 27.13±1.43 0.01 499.82±1.36 20.59±1.64 27.56±1.07 0.1 651.70±2.63* 58.27±2.94** 44.66±3.59 NP濃度 1 867.77±1.14** 71.02±1.83** 91.77±8.2** 10 873.69±2.34** 91.38±1.42** 118.85±7.35** 100 1 024.06±2.05** 158.14±4.68** 226.72±6.62**

由表1可知，各給藥組上清液中LDH、ALT、AST活性高于自然釋放對照組，且當NP濃度高于0.1 μmol/L時，上清液中LDH、ALT活性與自然釋放對照組相比具有顯著性差異，當NP濃度高于1 μmol/L時，上清液中AST活性與自然釋放對照組相比具有顯著性差異。結(jié)果說明，NP可增加NCTC1469細胞LDH、ALT、AST的滲透量，且呈一定的劑量依賴性。

2.3 NP對NCTC1469細胞內(nèi)ROS水平的影響

為了檢測NP是否影響NCTC1469細胞內(nèi)ROS水平，用不同濃度NP（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）作用NCTC1469細胞24 h后，利用DCFH-DA熒光探針標記，流式細胞儀測定細胞內(nèi)ROS生成。如圖2所示，經(jīng)NP刺激后，NCTC1469細胞內(nèi)ROS水平上升。由圖3可知，藥物作用組ROS水平與空白對照組相比具有顯著差異性，并呈劑量依賴性。

圖2 NP對NCTC1469細胞內(nèi)ROS水平影響的流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.2 Flow cytometer analysis of the effect of NP on ROS level in NCTC1469 cells

圖3 NP對NCTC1469細胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 3 Effect of NP on ROS level in NCTC1469 cells

2.4 NP對NCTC1469細胞內(nèi)GSH含量的影響

圖4 NP對NCTC1469細胞內(nèi)GSH含量的影響Fig.4 Effect of NP on GSH level in NCTC1469 cells

收集NP作用后的NCTC1469細胞，測定胞內(nèi)GSH含量，利用細胞蛋白含量校正。由圖4可見，NP刺激NCTC1469細胞后，與空白對照組相比，各藥物組胞內(nèi)GSH含量顯著降低，且呈一定的濃度劑量依賴性。

3 討 論

目前，NP對人類健康的潛在危害已引起廣大研究者關注。由于其是內(nèi)分泌干擾物的典型代表，因此可對機體內(nèi)分泌系統(tǒng)造成損害。然而在評估NP對機體的危害時，應綜合考慮其對整體的損傷作用。研究表明，母體暴露NP可引起幼鼠肝組織病變[11]，成年大鼠經(jīng)消化道染毒的亞慢性實驗結(jié)果也顯示肝、腎可能是NP作用的主要靶器官[12]。郭彤等[13]以鯽肝細胞作為毒理學模型發(fā)現(xiàn)當鯽肝細胞暴露于一定濃度范圍的壬基酚（＞0.1 μmol/L）環(huán)境下，在24 h內(nèi)能明顯抑制肝細胞增殖，并隨NP濃度的增加，抑制作用顯著增強。本實驗利用CCK-8法檢測NP對NCTC1469細胞存活率的影響，CCK-8分析法的原理是基于WST-8可被線粒體中的脫氫酶還原成水溶性的橙黃色甲臜染料，且生成的甲臜量與活細胞數(shù)量成正比。由本實驗結(jié)果可知，NP作用24 h后可抑制細胞增殖，并隨著藥物濃度增加，抑制效果愈加明顯，當NP濃度大于10 μmol/L時，其對NCTC1469細胞的生長抑制作用具有顯著性，推測肝細胞線粒體在高濃度NP作用下受到較大損傷。

體外肝細胞培養(yǎng)是一種簡便快速的體外毒理學實驗系統(tǒng)[14]。LDH是肝細胞內(nèi)一種重要的酶，可催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)機體正常生理活動，在正常情況下不會透過細胞膜，但當細胞受到損傷或毒害，細胞膜的通透性發(fā)生改變，LDH就會釋放到介質(zhì)中去[15]。ALT主要存在于肝細胞漿中，當肝細胞損傷使膜通透性改變，導致介質(zhì)中ALT活力明顯升高；AST主要分布在肝細胞的線粒體中，其余存在于胞漿，當肝細胞嚴重受損時，肝細胞線粒體進一步遭到破壞，大量AST釋放，使介質(zhì)中AST活力明顯升高[16]。因此，肝細胞培養(yǎng)液上清中LDH、ALT、AST漏出量是評價肝細胞受損的敏感指標。本實驗表明，各濃度NP作用NCTC1469細胞后，各給藥組上清液中LDH、ALT、AST活性高于自然釋放組，當NP濃度高于1 μmol/L時，上清液中LDH、ALT、AST活性與自然釋放對照組相比具有顯著性差異，且呈一定的劑量依賴性。其中，AST升高幅度高于ALT，提示肝細胞線粒體破壞，表明NP對NCTC1469細胞具有較強的損傷作用，破壞肝細胞生長微環(huán)境，引起膜通透性異常增大。

污染物在生物體內(nèi)代謝過程中可進行氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生大量的ROS，這些ROS可引發(fā)機體氧化應激，進而產(chǎn)生一系列的毒性效應[17-19]。相關研究表明，NP可使細胞內(nèi)ROS增加，調(diào)節(jié)細胞周期，抑制細胞增殖，甚至導致細胞死亡[20]。氧化應激不僅可由細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多而造成，細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)減少同樣可引起氧化應激。GSH是主要的細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)，在細胞內(nèi)參與氨基酸轉(zhuǎn)運，拮抗外源性毒物，修復氧自由基損傷，調(diào)節(jié)機體免疫功能以及維持細胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮著重要作用[21]。本實驗測定了NP作用后細胞內(nèi)ROS和GSH水平，結(jié)果顯示，NP刺激NCTC1469細胞后，細胞內(nèi)ROS水平與空白對照組相比顯著升高，并與NP作用濃度呈正相關。相反，NP作用后細胞內(nèi)GSH含量與空白對照組相比顯著降低，且呈一定劑量依賴性。提示NP可通過促進細胞內(nèi)ROS生成，減少細胞內(nèi)GSH含量，從而誘導NCTC1469細胞產(chǎn)生氧化應激。

總之，上述研究結(jié)果表明，小鼠肝細胞NCTC1469暴露于NP環(huán)境下時，使肝細胞增殖明顯降低，細胞培養(yǎng)上清液中LDH、ALT、AST滲出量明顯增加，表明一定濃度的NP對肝細胞具有損傷作用。同時，細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，且胞內(nèi)GSH含量顯著降低，造成細胞內(nèi)活性氧類產(chǎn)生過多超過抗氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡而對細胞造成損害。由此可以推測NP引起NCTC1469細胞的氧化應激效應可能是導致其毒性作用的機制之一。但NP究竟是如何通過細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導途徑對細胞造成損傷還需要做進一步的研究，因此大量的研究工作有待于今后繼續(xù)進行。

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Nonylphenol Induces Injury and Variations in ROS and GSH Content of NCTC1469 Cells

CHEN Yang-jie, LIU Xiao-zhen, HUANG Dan-fei, XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective：To explore the effect of nonylphenol (NP) on inducing injury and changing ROS and GSH contents in NCTC1469 cells. Methods: Cultured cells were treated with NP (0, 0. 01, 0.1, 1, 10 μmol/L and 100 μmol/L) for 24 h. Then, cell viability was assessed with a cell counting kit; the NP-induced injury was evaluated by detecting lactate dehydrogenase (LDH), alanine aminotransamine (ALT) and aspartate aminotransaminase (AST) activities in cell culture supernatant and the contents of intracellular glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) were assayed by flow cytometric method. Results: NP could inhibit NCTC1469 cell proliferation and promote ROS generation significantly in a dose-dependent manner. Compared with the control group, the LDH and ALT activities in cell culture supernatant from 0.1–100 μmol/L NP groups had a significant increase, while the AST activity increased dramatically only in 1–100 μmol/L NP groups. NP could decrease intracellular GSH content in a dose-dependent manner, and there was a significant difference when compared with the control group. Conclusion: NP can induce NCTC1469 cells injury by up-regulating the level of ROS and downregulating the content of GSH.

nonylphenol; NCTC1469 cells; oxidative stress

Q291

A

1002-6630（2014）03-0198-05

10.7506/spkx1002-6630-201403040

2013-10-10

國家“973”計劃項目 （2012CB720805）；科技部國際合作項目（2010DFA31780）；國家基金委中德科學基金中心合作項目（GZ731）

陳泱杰（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：chenyangjie0914@126.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品化學、食品營養(yǎng)與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn