1株素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌的分離與鑒定

李笑梅，賈冰心

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

1株素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌的分離與鑒定

李笑梅，賈冰心

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

以素食者糞便為樣品，大豆異黃酮為底物，對(duì)產(chǎn)雌馬酚的腸道菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定。采用紫外光譜法對(duì)雌馬酚定性、定量測(cè)定，用肉眼觀察、掃描電鏡、生理生化、16S rDNA全序測(cè)序方法對(duì)分離得到的LJ-G1腸道菌進(jìn)行菌株鑒定。結(jié)果表明：麥康凱和BHI培養(yǎng)基、厭氧平板劃線培養(yǎng)法更適于產(chǎn)雌馬酚腸道菌的分離篩選。采取10 g糞樣稀釋到10-5接種，在pH 7.3、溫度37 ℃、厭氧培養(yǎng)36 h的條件下，培養(yǎng)基中雌馬酚產(chǎn)出量達(dá)到10 μg/mL以上。經(jīng)鑒定分離得到的LJ-G1菌株為G－桿菌；根據(jù)生理生化反應(yīng)結(jié)果，查閱《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，確定LJ-G1為河生腸桿菌；16S rDNA全序測(cè)序顯示與腸桿菌同源性達(dá)99%。

素食者；腸道菌；雌馬酚；分離；鑒定

雌馬酚(equol)是大豆異黃酮在人腸道菌作用下的代謝終產(chǎn)物，具有雌激素活性，大豆異黃酮的植物雌激素生物活性，更多是由雌馬酚來實(shí)現(xiàn)的[1-2]。人體內(nèi)能否將大豆異黃酮代謝產(chǎn)生馬雌酚，主要取決于腸道微生物菌群的組成及代謝能力[3-4]。宿主基因和膳食結(jié)構(gòu)會(huì)影響腸道菌群而使個(gè)體菌株產(chǎn)雌馬酚的能力有差異[5-6]。不同人種間、素食者和非素食者產(chǎn)雌馬酚的能力差異明顯，素食者比非素食者更容易降解大豆異黃酮，產(chǎn)雌馬酚比例高于非素食者[7]。近5年來，多株產(chǎn)雌馬酚菌株從人類和動(dòng)物的消化道內(nèi)被分離出來[8-12]，但是以素食人群為對(duì)象的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究是從素食者糞樣中分離出高產(chǎn)雌馬酚腸道菌，并進(jìn)行菌株鑒定，旨在深入了解產(chǎn)雌馬酚相關(guān)細(xì)菌的種類和分離培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)特性，為雌馬酚生物合成應(yīng)用技術(shù)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 材料與試劑

糞樣采自哈爾濱某寺廟素食者。

大豆異黃酮（純度80%） 西安市天園生物制藥廠；大豆異黃酮保健品（每片異黃酮含量＞6 mg） 哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 合肥蘭旭生物有限公司；活性炭 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；聚酰胺 吉林省宏久科技公司；無水乙醇、葡萄糖、乳糖 天津市化學(xué)試劑一廠；吐溫-80 上海山浦化工有限公司；瓊脂粉 上海醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠；厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1900型雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司；YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療機(jī)械有限公司；腸桿菌生理生化編碼鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司；H-7650 透射電子顯微鏡 日立株式會(huì)社制作所。

1.2 方法

1.2.1 雌馬酚定量測(cè)定

用TU-1900型雙光束紫外分光光度計(jì)，在190～400 nm波長(zhǎng)下掃描雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定最大吸收波長(zhǎng)205 nm，回歸方程y＝0.1026x＋0.0343(R2=0.999 9)。采用紫外光譜法對(duì)素食者的尿液和培養(yǎng)基中的雌馬酚含量進(jìn)行測(cè)定[13-14]，根據(jù)下式計(jì)算培養(yǎng)基中雌馬酚含量。

式中：ρ1為培養(yǎng)基中雌馬酚質(zhì)量濃度/(μg/mL)；V1為培養(yǎng)基體積數(shù)/mL；V2為定容后體積數(shù)/mL；ρ2為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)得的定容液中雌馬酚質(zhì)量濃度/(μg/mL)。

1.2.2 供試者篩選

在寺廟中招募18～30歲的6名女性素食者，分別取她們正常飲食、禁食大豆制品7 d和連續(xù)服用大豆異黃酮保健品7 d后的尿液，測(cè)定雌馬酚含量，選擇尿樣雌馬酚含量較高者為糞樣供試者。

1.2.3 糞樣處理及適宜稀釋度選擇

用無菌棉簽取供試者晨便，迅速裝入密閉容器加并入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋。稱取10 g糞樣，加入90 mL的無菌水10-1稀釋制得樣液，依次進(jìn)行倍比稀釋，制成10-1～10-10稀釋液。選用劃線法將10個(gè)稀釋液分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在36.5 ℃厭氧條件下培養(yǎng)36 h，根據(jù)菌落數(shù)量適宜（100～200 CFU）、無重疊、邊緣清楚及雌馬酚含量確定最佳稀釋度，作為下面1.2.4節(jié)接種濃度。

1.2.4 培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的選擇

腸道菌大多數(shù)為厭氧菌[15]，分別采用平板培養(yǎng)法、滾管培養(yǎng)法、厭氧管培養(yǎng)法，在厭氧條件下培養(yǎng)（n=3）。視菌落的形態(tài)、雌馬酚含量及操作難易綜合考慮，選定培養(yǎng)方法。

根據(jù)已有報(bào)道[16-17]，適宜腸道菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基包括：MRS培養(yǎng)基、IRIE培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、青春雙歧桿菌培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基。在每種培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的大豆異黃酮底物1.5 mL（含大豆異黃酮6 mg），然后接種10-5樣液（n=3），對(duì)培養(yǎng)基中雌馬酚定性定量篩選適宜培養(yǎng)基。同時(shí)每種培養(yǎng)基作底物空白對(duì)照組和糞樣空白對(duì)照組。

1.2.5 產(chǎn)雌馬酚腸道菌的分離

將10-5樣液接種于選定的培養(yǎng)基（含大豆異黃酮6 mg）上，置于36.5 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。再將不同的菌落分別接種在培養(yǎng)基上，反復(fù)培養(yǎng)純化，篩選具有產(chǎn)雌馬酚能力的腸道菌。

1.2.6 產(chǎn)雌馬酚腸道菌的鑒定

形態(tài)觀察：首先觀察3代純培養(yǎng)平板上的菌落形態(tài)，然后進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)，再在電鏡下觀察菌體形態(tài)。

生理生化反應(yīng)：用接種環(huán)將菌液接至腸道菌生理生化鑒定管內(nèi)，進(jìn)行生理生化反應(yīng)觀察其結(jié)果，對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行屬種鑒定。

16S rDNA[17]全序測(cè)定：提取菌株的基因組DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，在DNA完整的條件下，用正引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、反引物1492r（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）對(duì)此菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在相應(yīng)的反應(yīng)體系和條件下，將得到有效測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接。將測(cè)序結(jié)果利用NCBI提供的BLASTn工具等相關(guān)軟件與已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方式的比較

不同培養(yǎng)方式的培養(yǎng)基中雌馬酚含量的測(cè)定結(jié)果見表1。除IRIE外不同培養(yǎng)方式下的各種培養(yǎng)基中，大豆異黃酮添加組的雌馬酚含量均高于未添加組；在大豆異黃酮添加組中，平板培養(yǎng)法的雌馬酚含量高于其他各組，最終選擇平板法作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)方式。此外，麥康凱和BHI培養(yǎng)基中雌馬酚含量高于其他培養(yǎng)基，未添加組也有少量雌馬酚產(chǎn)生。

表1 不同培養(yǎng)方式的培養(yǎng)基中雌馬酚含量Table 1 Equol content in media for different culture methods μg/mL

2.2 最適培養(yǎng)基的篩選

不同培養(yǎng)基中雌馬酚含量的測(cè)定結(jié)果見表2。空白對(duì)照組各培養(yǎng)基均未生長(zhǎng)菌落。在樣品＋底物組的5種培養(yǎng)基中，麥康凱和BHI培養(yǎng)基雌馬酚含量較高，均達(dá)到10 μg/mL，且菌落生長(zhǎng)形態(tài)好于其他組，此結(jié)果與表1結(jié)果一致，可互為驗(yàn)證。因此確定麥康凱和BHI培養(yǎng)基作為后續(xù)研究的工作培養(yǎng)基。無底物空白對(duì)照組也檢測(cè)到雌馬酚，但含量明顯低于樣品＋底物組，含量水平在1.00～1.90 μg/mL，原因可能是在培養(yǎng)基成分中還含有可參與代謝產(chǎn)雌馬酚的其他物質(zhì)，有待進(jìn)一步分析。

表2 不同培養(yǎng)基各組雌馬酚含量Table 2 Equol contents in different media μg/mL

2.3 產(chǎn)雌馬酚腸道菌的分離結(jié)果

通過最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法的篩選，麥康凱培養(yǎng)基平板劃線分離得到菌株LJ-G1產(chǎn)雌馬酚量相對(duì)較高可達(dá)10.033 μg/mL，結(jié)果見圖1。在麥康凱培養(yǎng)基分離得到的LJ-G1菌落呈白色、圓形隆起、邊緣整齊，并且菌落會(huì)深入到培養(yǎng)基內(nèi)，可能此菌種是運(yùn)動(dòng)的。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基上的LJ-G1菌株Fig.1 LJ-G1strain in Makanke medium

2.4 產(chǎn)雌馬酚腸道菌的鑒定

2.4.1 革蘭氏染色及電鏡掃描

圖2 LJ-G1革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of LG-G1

圖3 LJ-G1掃描電鏡（×1 500）Fig.3 Scanning electron micrograph of LJ-G1 (×1 500)

菌株LJ-G1革蘭氏染色及掃描電鏡觀察結(jié)果分別見圖2、3。菌株LJ-G1為革蘭氏陰性，單個(gè)或成排，呈條棒狀，為桿菌。有報(bào)道產(chǎn)雌馬酚菌株多為革蘭氏陽性桿菌屬，如蔡莉[9]、孫遜[18]、Tamura[19]等的報(bào)道，革蘭氏陰性菌株的報(bào)道較少，Wang Xiuling等[20]從一個(gè)健康女性糞樣中分離出1株革蘭氏陰性桿狀厭氧細(xì)菌Julong732。

由圖3A可知，菌株大小（0.6～0.9）μm×（2.0～20.0）μm，單個(gè)或成對(duì)，菌體呈棒狀，頂端圓或尖，能形成短鏈，偶見長(zhǎng)鏈，不產(chǎn)芽孢，鞭毛周生（圖3B）。

2.4.2 菌株的生理生化反應(yīng)

菌株LJ-G1生理生化反應(yīng)結(jié)果見表3。LJ-G1不產(chǎn)生吲哚，不能利用檸檬酸鹽、賴氨酸、苯丙氨酸及尿素，不能水解淀粉，硫化氫實(shí)驗(yàn)陰性；此菌株可利用鳥氨酸，并發(fā)酵葡萄糖及乳糖產(chǎn)生氣體，能液化明膠。

表3 菌株LJ-G1生理生化反應(yīng)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characterization of strain LJ-G1

2.4.3 16S rDNA測(cè)序結(jié)果

圖4 DNA提取膠Fig.4 Electrophoretic analysis ofextracted DNA

提取菌株總DNA及PCR產(chǎn)物結(jié)果如圖4、5所示。菌株LJ-G1的基因組提取完整、未降解，可用做PCR擴(kuò)增的模版。且PCR擴(kuò)增得到大小約1 500 bp的產(chǎn)物，與細(xì)菌16S rDNA大小相符，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證，將菌株的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有數(shù)據(jù)在線比對(duì)，結(jié)果顯示菌株LJ-G1的16S rDNA與Enterobacter sp.、Bacterium fjat-scr-2、Enterobacter amnigenus、Bacterium hswx111、Uncultured gamma proteobacterium的同源性達(dá)到99%，由16S rDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖6所示。

圖5 PCR產(chǎn)物鑒定Fig.5 Identification of PCR products

圖6 基于16SrDNA序列同源性的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rDNA sequences

根據(jù)16S rDNA測(cè)定結(jié)果，菌株LJ-G1與腸桿菌屬(Enterobacter Hormaeche and Edwards)同源性達(dá)99%，結(jié)合LJ-G1的形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)鑒定結(jié)果，再查閱《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》得出：LJ-G1菌株屬于河生腸桿菌(Enterobacter amnigenus)。

3 結(jié) 論

從素食者糞便中分離出能利用大豆異黃酮產(chǎn)雌馬酚的腸道菌LJ-G1，更適于采用麥康凱培養(yǎng)基、厭氧平板劃線培養(yǎng)法分離篩選。培養(yǎng)條件pH 7.3、溫度37 ℃、厭氧培養(yǎng)36 h，在此條件下培養(yǎng)基中雌馬酚產(chǎn)出量較高達(dá)10 μg/mL以上。菌株革蘭氏染色呈陰性，根據(jù)16S rDNA測(cè)序結(jié)果，LJ-G1與腸桿菌屬(Enterobacter Hormaeche and Edwards) 同源性達(dá)99%，依據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化反應(yīng)，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》得出LJ-G1菌株為河生腸桿菌(E. amnigenus)。素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌其他菌株的分離、鑒定及生長(zhǎng)特性研究有待后續(xù)工作的進(jìn)一步研究。

此外在研究過程中發(fā)現(xiàn)，未添加底物的空白組雌馬酚檢出呈陽性，但檢出量較低，說明糞樣中或培養(yǎng)基成分中含有大豆異黃酮以外的其他底物，還有待探討。

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Isolation and Identification of An Equol-Producing Bacterial Strain from Vegetarian Intestinal Tract

LI Xiao-mei, JIA Bing-xin
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

An intestinal bacterial strain with the ability to metabolize soy isofl avone to equol was isolated from vegetarian feces. Qualitative and quantitative analysis of equol was performed by ultraviolet spectrophotometry. The isolated strain was identifi ed through naked-eye observation, scanning electron microscope, physiological and biochemical characterization and 16S rDNA full-length sequencing. The results showed that Makanke medium, BHI medium and anaerobic plate streaking cultivation method were suitable for isolating intestinal bacteria producing equol. The optimal culture conditions for enhanced equol production were 10 g of fecal sample diluted in advance to 10-5inoculated into 6 mg of substrate at an initial medium pH of 7.3, followed by anaerobic culture at pH 7.3 for 36 h. The strain was identifi ed as LJ-G1, a Gam-negative bacillus. According to physiological and biochemical properties and referring the Common Bacterial System Identifi cation Manual, LJ-G1 belonged to Enterobacter amnigenus. The results of 16S rDNA full-length sequencing showed 99% homology with the intestinal bacterium.

vegetarian; intestinal bacteria; equol; isolation; identifi cation

TS201.3

A

1002-6630（2014）03-0153-04

10.7506/spkx1002-6630-201403031

2013-09-29

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201201）；黑龍江省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2010td04）

李笑梅（1960—），女，教授，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。 E-mail：lixm0451@163.com