釀酒條件對兩株商業釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響

張方方，江 璐，劉延琳,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

釀酒條件對兩株商業釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響

張方方1，江 璐1，劉延琳1,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

研究釀酒條件（氧氣、pH值、溫度、糖和乙醇等）對兩株商業釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響。結果顯示：氧氣促進酵母β-葡萄糖苷酶的合成，兩株商業釀酒酵母完整細胞的β-葡萄糖苷酶最適pH值為5.0，最適溫度為60℃，果糖、葡萄糖和蔗糖對兩株釀酒酵母完整細胞的β-葡萄糖苷酶活性具有輕微抑制作用，乙醇（體積分數2%～20%）促進β-葡萄糖苷酶的酶活力。在葡萄酒發酵過程中，β-葡萄糖苷酶主要存在于完整細胞和透性化細胞中，上清液中酶較少。

釀酒酵母；β-葡萄糖苷酶；葡萄汁發酵

香氣是葡萄酒重要特征之一，葡萄汁、葡萄酒中許多香氣成分（如里那醇、里那醇氧化物、香葉醇、橙花醇、香茅醇、α-萜品醇等）是以糖苷形式存在的。β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是糖苷水解的關鍵酶[1]，在微生物（如細菌、酵母和霉菌）中廣泛存在，也存在于植物中，主要用于增強葡萄酒、啤酒和果汁的感官特性，特別是香氣[2-3]。β-葡萄糖苷酶水解糖苷，釋放揮發性糖苷配基，如萜烯醇，增加葡萄酒香氣。葡萄中含有單糖苷和二糖苷，二糖苷的水解，首先在α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶或β-D-洋芹糖苷酶作用下切斷相應二糖苷的糖苷鍵，形成β-D-葡萄糖單糖苷，然后在β-葡萄糖苷酶的作用下釋放揮發性物質[4]。β-葡萄糖苷酶是糖苷水解的關鍵酶[5]，因此大部分研究主要集中于β-葡萄糖苷酶[2,6-7]。

在葡萄酒釀造過程中，β-葡萄糖苷酶主要來自于葡萄[8]和參與葡萄酒發酵的微生物（如酵母[9]和乳酸菌[10]），但在釀酒條件下葡萄自身合成的酶幾乎沒有活性。釀酒酵母能合成β-葡萄糖苷酶[11]，但葡萄酒的發酵是一個厭氧的過程，因此氧氣影響酵母合成β-葡萄糖苷酶。在葡萄酒發酵的過程中，pH值、溫度、糖、乙醇等因素同樣影響釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶的活性，研究發現在這些條件下β-葡萄糖苷酶的酶活低，甚至沒有酶活[12]。目前，對釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的研究較少[13-15]，尤其在發酵過程中酵母產β-葡萄糖苷酶[16-17]方面。本實驗主要研究不同的釀酒條件對兩株商業釀酒酵母RC212和VL1的β-葡萄糖苷酶的影響，以及釀酒過程中酵母產β-葡萄糖苷酶的動態變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業釀酒酵母RC212和VL1。

寧夏御馬酒廠霞多麗葡萄汁，含糖量200 g/L、總酸6.88 g/L（酒石酸計），pH 3.89。

pNPG（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，≥98%（TLC））、咪唑（≥98.5%） 美國Sigma公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、葡萄糖、蔗糖 天津博迪化工股份有限公司；還原態谷胱甘肽（≥98%）、Triton X-100（試劑級） 美國Amresco公司；甲苯、乙醇（分析純） 西安三浦化學試劑有限公司；果糖（分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

YPD液體培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，pH 5.0；WL固體培養基：酵母浸粉4 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鐵0.002 5 g/L、硫酸錳0.002 5 g/L、溴甲酚綠22 mg/L、瓊脂20 g/L，pH 6.5。培養基滅菌條件：121℃、20 min。

1.2 儀器與設備

MJPS-250型霉菌培養箱、DHG-9071A鼓風干燥箱、DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；FRESC017型高速冷凍離心機 美國Thermo公司；UV1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養

取100 μL、－20 ℃保存的菌種接種至5 mL YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min活化24 h。活化的菌株接種至含有1/5體積的YPD （pH 5.0）液體培養基的三角瓶中，接種量為體積分數1%，28 ℃、180 r/min，培養24 h后取樣，每個樣品重復2次。

1.3.2 樣品處理

上清液：取1 mL菌液，10 000×g、4 ℃離心10 min，取0.2 mL上清液，測定上清液中的酶活力。

完整細胞：取1 mL菌液，10 000×g、4 ℃離心10 min，菌體用1 mL冷卻無菌水洗2次，加入0.2 mL pH 5.0、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖溶液，所得菌液用于測定完整細胞的酶活力。

透性化細胞：取1 mL菌液，10 000×g、4 ℃離心10 min，菌體用1 mL冷卻無菌水洗2次，加1 mL 0.075 mol/L pH 7.5咪唑緩沖溶液，迅速加0.05 mL 0.3 mol/L谷胱甘肽，0.01 mL質量分數10% triton X-100，0.05 mL甲苯-乙醇（體積比1∶4），劇烈振蕩5 min，10 000×g、4 ℃離心10 min，得到的菌體用1 mL冷卻無菌水洗2次，加入0.2 mL pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖溶液，用于透性化細胞酶活力（酵母的胞內酶）分析[12]。

細胞干重：取4 mL菌液，10 000×g離心10 min，用冷卻的無菌水洗2次，105 ℃烘至恒質量，分析天平稱質量。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活力測定

分別取0.2 mL上清液、完整細胞液和透性化細胞液，加入0.2 mL pNPG（5 mmol/L溶于pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖液中），30 ℃水浴反應1 h后，加入pH 10.2、0.2 mol/L碳酸鈉緩沖溶液終止反應，400 nm波長測定吸光度[12]。β-葡萄糖苷酶的酶活力單位為在1 h內1 mL上清液中反應生成對硝基苯酚量（?mol）或每小時每毫克干細胞質量中生成的對硝基苯酚量（?mol），即μmol/(mL·h)和μmol/(mg·h)。

1.3.4 釀酒條件對完整細胞β-葡萄糖苷酶的影響

1.3.4.1 氧氣

有氧培養：按1%接種量，將活化的菌株培養液接種至含有1/5體積YPD液體培養基（pH 5.0）的三角瓶，28 ℃、180 r/min培養24 h；厭氧培養：按相同接種量接種至含有80%體積YPD液體培養基（pH 5.0）的離心管中厭氧靜止培養3 d，分別取樣測定完整細胞的酶活力，每個樣品重復測定2次。

1.3.4.2 pH值

在30 ℃條件下，pH值分別為3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中測定完整細胞β-葡萄糖苷酶的酶活力，每個樣品重復測定2次。

1.3.4.3 溫度

在pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖液中，分別在15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 ℃溫度下測定兩株商業釀酒酵母完整細胞的酶活力，每個樣品重復測定2次。

1.3.4.4 糖

在pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，果糖、葡萄糖和蔗糖質量濃度分別為0、20、40、80、120、160、200 g/L，30 ℃測定完整細胞的酶活力，每個樣品重復測定2次。

1.3.4.5 乙醇

在pH 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，分別加入體積分數0%、2%、4%、8%、12%、16%、20%的乙醇，30 ℃測定完整細胞的酶活力，每個樣品重復測定2次。

1.3.5 葡萄酒微型發酵

將活化的商業釀酒酵母RC212、VL1接種至400 mL經巴氏殺菌（70 ℃保持20 mim，然后降至室溫，每天一次，連續3 d）的葡萄汁中，接種量為106cells/mL（血球計數法計數），18 ℃靜止發酵，每個樣品重復測定2次。監測發酵過程中CO2失重、酵母細胞數量的變化、酵母產β-葡萄糖苷酶（上清液、完整細胞和透性化細胞）。CO2失重連續3 d不變說明發酵結束，每個樣品重復測定2次。不同部位酵母的β-葡萄糖苷酶的量表示為每小時1 mL菌液中反應生成的對硝基苯酚的?mol數。

2 結果與分析

2.1 氧氣對酵母產酶的影響

表1 氧氣對酵母產β-葡萄糖苷酶的影響Table 1 Effect of oxygen onβ-glucosidase activity from Saccharomyces cereviissiiaaee

由表1可知，氧氣對酵母不同部位的β-葡萄糖苷酶的影響不同，氧氣對上清和透性化細胞中酶活力有顯著影響。厭氧條件下，RC212與VL1的上清液中酶活分別降低了22.20%和27.89%，透性化細胞中的酶活分別降低了33.00%和49.07%。而氧氣對完整細胞酶活的影響不同，厭氧條件下RC212完整細胞中酶活增加了32.04%，而對VL1完整細胞中酶活的影響不顯著，整體而言，氧氣促進酵母產酶。

2.2 pH值對完整細胞酶活力的影響

pH值對完整細胞的β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖1所示，以最高值為100.00%，兩株商業釀酒酵母的變化趨勢基本上一致，pH5.0時酶活力最高，因此最適pH值為5.0。pH值為3.4～4.0時，RC212完整細胞的相對酶活力為31.80%～60.73%，VL1完整細胞的相對酶活力為40.08%～69.92%。其他一些研究也證明了低pH值對β-葡萄糖苷酶酶活力具有抑制作用[18]。

圖1 pH值對酵母完整細胞β--葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.1 Effect of pH on β-glucosidase activity in whole cells

2.3 溫度對完整細胞酶活力的影響

pH 5.0條件下，不同反應溫度（15～70 ℃）對酶活力的影響結果如圖2所示，以30 ℃的酶活為100.00%。60 ℃時，兩株商業釀酒酵母完整細胞的β-葡萄糖苷酶酶活力最高，RC212與VL1的相對酶活力分別為275.00%和248.00%；20 ℃時，RC212與VL1的相對酶活力分別為43.64%和43.74%。隨著溫度的升高酶活力逐漸升高，溫度超過60 ℃后急劇下降，這種現象可能是由于溫度的升高增加酶的反應速度，但溫度過高導致蛋白質變性從而酶活力迅速降低。

圖2 溫度對酵母完整細胞β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on β-glucosidase activity in whole cells

2.4 糖對完整細胞酶活力的影響

葡萄汁中的糖（果糖、葡萄糖和蔗糖）對β-葡萄糖苷酶的酶活抑制現象十分普遍，不僅抑制釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶活力，對非釀酒酵母、黑曲霉的β-葡萄糖苷酶也有抑制作用[18-20]。果糖、葡萄糖和蔗糖對酵母完整細胞β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖3所示，以不添加糖時酵母的相對酶活力為100.00%。糖對β-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強弱稍有不同，葡萄糖抑制作用最強，特別是對RC212。葡萄汁中葡萄糖和果糖大約各占50%，果糖、葡萄糖和蔗糖含量為120 g/L時，RC212完整細胞的β-葡萄糖苷酶的相對酶活力分別為66.01%、63.25%和66.12%，VL1完整細胞的相對酶活力為75.11%、71.02%和74.36%。

圖3 果糖（A）、葡萄糖（B）、蔗糖（C）對完整細胞β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.3 Effects of fructose (A), glucose (B) and sucrose (C) concentrations on β-glucosidase activity in whole cells

2.5 乙醇對完整細胞酶活力的影響

乙醇既能抑制酵母的β-葡萄糖苷酶活性[19]，也能促進其活性。乙醇對酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖4所示，以不添加乙醇時β-葡萄糖苷酶的相對酶活力為100.00%。乙醇體積分數為12%時，RC212和VL1完整細胞的酶活力分別增加19.39%和25.86%，乙醇體積分數為20%時，RC212和VL1完整細胞的酶活力分別增加30.33%和23.84%，乙醇對酶的這種影響對葡萄酒的釀造有重要意義。乙醇體積分數范圍在2%～20%時，VL1完整細胞的酶活力逐漸升高，乙醇體積分數在16%時，酶活力達到最高，隨后稍有下降，可能是由于乙醇導致酶結構的變化，引起酶活性部位的變化，從而降低其活力[20]。乙醇促進β-葡萄糖苷酶的活性可能是由于酶固定在酵母的細胞膜上，酶的內部結構和酶活部位或酶自身的保護機制減少蛋白質的解折疊率[21]；β-葡萄糖苷酶具有糖基轉移酶活性，乙醇具有親核性，可以作為糖基轉移時的中間受體，導致酶活力的增加[22-23]；較高的乙醇含量可能改變膜透性，使底物與胞內酶作用[24]。

2.6 葡萄酒微型發酵

RC212、VL1分別是紅、白葡萄酒發酵常用的商業釀酒酵母，利用二氧化碳的失重監測酵母的發酵情況，結果如圖5A所示。這兩株釀酒酵母的發酵力相似，RC212、VL1分別在17、15 d發酵結束。發酵過程中酵母數量的變化如圖5B所示，酵母細胞數量在3 d后達到穩定期，發酵末期酵母數量仍然能保持較高水平。

圖5 葡萄汁發酵過程中發酵速率（A）及酵母細胞數（B）的變化Fig.5 Fermentation kinetics (A) and yeast population (B) during grape juice fermentation

圖6 葡萄汁發酵過程中上清液（A）、完整細胞（B）及透性化細胞（CC）中β-葡萄糖苷酶酶量的變 化Fig.6 Changes in β-glucosidase activity in supernatant (A), whole cells (B) and permeabilized cells (C) during grape juice fermentation

發酵過程中β-葡萄糖苷酶酶量的變化如圖6所示，兩株酵母β-葡萄糖苷酶的變化趨勢基本相似，上清液中的酶在發酵48h時，達到產酶高峰（圖6A），RC212與VL1上清中的最大值分別為0.30、0.32 ?mol/（mL·h），隨后明顯下降，完整細胞（圖6B）和透性化細胞（圖6C）的產酶高峰分別在發酵的3 d和5 d，RC212與VLI完整細胞β-葡萄糖苷酶酶量最高值分別為1.04、1.07 ?mol/（mL·h），透性化細胞中酶量最高值分別為1.34、1.46 ?mol/（mL·h）。

酶的生物合成與轉移和酵母生長期的代謝有密切關系[25]，代謝旺盛、產酶高、酶轉移較快。在酵母的指數生長期，上清液的β-葡萄糖苷酶酶量達到最高，這一時期酵母活動旺盛，因此酶的運轉也較快，發酵后期，酵母逐漸衰老、產酶降低。發酵過程中上清液、完整細胞和透性化細胞中β-葡萄糖苷酶到達峰值的時期不同，上清液、完整細胞和透性化細胞的產酶最高峰逐漸延后。

3 結 論

在有氧條件下，酵母生長旺盛，氧氣促進酵母β-葡萄糖苷酶的合成，在其他研究中，也得到相同的結論[6,12]。兩株釀酒酵母RC212和VL1的β-葡萄糖苷酶最適pH值為5.0，最適溫度為60 ℃，15～20 ℃時酵母的酶活較低。較低的pH值抑制酵母的β-葡萄糖苷酶活性，pH值為3.4～4.0時，RC212的相對酶活力為31.80%～60.73%，VL1的相對酶活力為40.08%～69.92%。糖對β-葡萄糖苷酶的酶活抑制較弱，乙醇促進β-葡萄糖苷酶的酶活力。溫度和pH值是限制β-葡萄糖苷酶活性的主要因素。

在葡萄汁發酵過程中，兩株釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶主要分布在完整細胞和透性化細胞中，上清液的酶比較少，透性化細胞中的酶是胞內酶，對于糖苷的水解不起作用，只有轉移到細胞表面或細胞外才能起作用。在葡萄汁發酵的過程中釀酒酵母雖然能合成β-葡萄糖苷酶，但是葡萄酒發酵過程中氧氣、溫度、pH值、糖和乙醇都影響β-葡萄糖苷酶酶活。本實驗研究了氧氣、溫度、pH值、糖和乙醇對酵母的β-葡萄糖苷酶活性的影響及發酵過程中β-葡萄糖苷酶的動態變化，但β-葡萄苷酶對葡萄酒香氣的影響還需要進一步研究。

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Effect of Winemaking Conditions on β-Glucosidase Activity from Two Commercial Saccharomyces cerevisiae Strains

ZHANG Fang-fang1, JIANG Lu1, LIU Yan-lin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;
2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-viniculture, Yangling 712100, China)

The present study aimed to investigate the effect of vinification environments such as oxygen, pH, temperature, sugar and ethanol on β-glucosidase activity from two commercial Saccharomyces cerevisiae strains. The results showed that aerobic condition stimulated β-glucosidases biosynthesis. The optimal pH and temperature for β-glucosidase activity from the whole cells of both strains were 5.0 and 60 ℃, respectively. β-Glucosidase activity was slightly inhibited by fructose, glucose and sucrose. An ethanol concentration between 2% and 20% could activate β-glucosidase from the two S. cerevisiae strains. During grape juice fermentation, the enzyme was mostly in both whole cells and permeabilized cells, while the activity in the culture supernatant was low.

Saccharomyces cerevisiae; β-glucosidase; grape juice fermentation

TS261.1

A

1002-6630（2014）03-0148-05

10.7506/spkx1002-6630-201403030

2013-03-23

國家自然科學基金項目（31271917）；西北農林科技大學基本科研業務費專項（22050205）；國家現代農業（葡萄）產業技術體系建設專項（CARS-30-jg-3）

張方方（1984—），女，碩士研究生，研究方向為葡萄酒微生物。E-mail：zhangfangfang8875@163.com

*通信作者：劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向為釀酒微生物及葡萄-葡萄酒學。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn