燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復合物的體外穩定性

馬雅欽，高瑞萍,2，劉 嘉，趙國華,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.遵義醫學院公共衛生學院，貴州 遵義 563000；3.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶 400715）

燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復合物的體外穩定性

馬雅欽1，高瑞萍1,2，劉 嘉1，趙國華1,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.遵義醫學院公共衛生學院，貴州 遵義 563000；3.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶 400715）

為研究燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復合物在模擬胃腸液中的穩定性，采用真空冷凍干燥法制備燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復合物。在模擬胃腸液中通過不同pH值和復合物質量濃度，探討在胃腸液中pH值和復合物質量濃度對于復合物穩定性的影響。結果表明：在胃液和腸液中，pH值越低，復合物越穩定。由于進食會使得胃腸液的pH值增大，表明在禁食狀態下復合物狀態更穩定。復合物質量濃度越大，其在胃腸液中的穩定性越高，且達到在0.8 mg/L時，180 min孵育后復合物穩定性均達到80%以上。由此表明可以通過適當增大復合物的質量濃度來提高胃腸液的穩定性。

燕麥β-葡聚糖；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；復合物；模擬胃腸液；穩定性

目前，膳食纖維與多酚形成的復合物在醫藥、食品領域的應用備受關注[1]。多酚和多糖可以通過氫鍵、疏水相互作用、共價鍵相互作用結合[2]。多糖多酚復合物在調節胃腸道中多酚的游離濃度方面起著重要的作用[3-6]。燕麥β-葡聚糖作為一種可溶性膳食纖維，主要以細胞結構成分的形式存在[7-10]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中主要功能成分，具有增強機體抵抗力、抗氧化性、抗癌、降血糖血脂等生理功能[10-15]。前期研究表明β-葡聚糖可吸附茶多酚形成復合物[16]，而且在合適濃度下二者的復合作用在產物的抗氧化性影響方面表現為增效作用[17]。人工模擬胃腸液中pH值和兒茶素濃度對其穩定性具有較大影響[18]。但pH值和復合物質量濃度對于燕麥β-葡聚糖-EGCG復合物的影響尚不清楚。利用燕麥β-葡聚糖-EGCG復合物為實驗材料，通過不同pH值梯度和不同復合物質量濃度的模擬胃腸液，探討在胃腸液中pH值和復合物質量濃度對于復合物穩定性的影響，以期為探討β-葡聚糖-EGCG復合物的體內生物學作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥β-葡聚糖 鄭州荔諾生物科技公司。

EGCG 杭州禾田生物科技有限公司；胃蛋白酶（1∶10 000）、胰蛋白酶（1∶1 000） 美國Sigma公司；色譜甲醇 天津四友化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純 成都科龍試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

WS-26恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；PB-10標準型電化學分析儀、pH計（酸度計） 德國賽多利斯公司；ALPHA 1-4/2 -4LSC真空冷凍干燥機 德國Christ公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥β-葡聚糖-EGCG復合物制備

參照實驗前期的方法制備燕麥β-葡聚糖-EGCG復合物[16]。將2 mL 0.7 mg/mL的EGCG和6 mL 0.5 mg/mL葡聚糖（均溶于pH 5.80、0.1 mol/L的PBS溶液）置于經處理的透析袋內，將透析袋浸入30 mL pH 5.80、0.1 mol/L的PBS溶液，50 ℃透析16 h后將透析袋于流水透析24 h后再用超純水透析24 h以除去其中的磷酸鹽。把透析袋內溶液進行冷凍干燥得復合物，于4 ℃避光保存備用。

1.3.2 EGCG的測定

游離的E GCG采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）方法測定。具體測定條件參考肖俊松等[19]并進行優化：色譜柱為Hypersil BDS（4.6 mm×250 mm）。流動相A為100%甲醇，流動相B為2%乙酸溶液，采用等度洗脫10 min，流動相由甲醇（A）、2%的乙酸（B），體積比為25∶75，流速0.9 mL/min，檢測波長278 nm。復合物中EGCG的含量測定參照Tosh等[21]的酸水解方法并加以改進，稱取100 mg在1.3.1節中制備的復合物溶解在100 mL超純水中，加1.0 mol/L的鹽酸調至pH 1.0，在70 ℃孵育50 min，冰浴中冷卻至室溫，用2 mol/L的NaOH調節至中性pH 6～7，將溶液經0.45 μm濾膜過濾后，HPLC測定EGCG含量即為復合物中的EGCG含量[20]。

1.3.3 復合物穩定性表示與計算

復合物的穩定性用復合物中EGCG的保留率表示，按照下式計算：

1.3.4 模擬胃腸液的制備

參照Hussain等[22]的方法配制胃腸液。模擬胃液的配制方法是稱取3.2 g胃蛋白酶和7 mL 37% HCl加入1 L的容量瓶，用超純水定容；模擬腸液的配制方法是稱取6.8 g磷酸二氫鉀溶于1 L超純水，加入3.2 g胰蛋白酶，NaOH調節pH 6.8。

1.3.5 體外模擬胃腸液的pH值對復合物穩定性的影響

用HCl和NaOH對胃腸液的pH值進行調節，使胃液pH值為1.5～4.0，腸液pH值為5～8，稱取12.5 mg復合物分別溶于25 mL不同pH值的胃液和腸液配成0.5 mg/mL的溶液，搖勻，于37 ℃保溫30～180 min，經0.45 μm濾膜過濾后測定游離的EGCG。

1.3.6 復合物質量濃度對其在模擬胃腸液中穩定性的影響

分別稱取12.5、15、17.5、20、22.5、25 mg復合物于pH 1.5的胃液和pH 6.8的腸液配制0.5～1.0 mg/mL的溶液，于37 ℃保溫30～180 min。經0.45 μm濾膜后HPLC測定解離的EGCG的量。

1.4 數據處理

以上實驗均重復3次，以復合物穩定性作為最終數據，數據結果以來表示。利用Origin作圖軟件，以時間為橫坐標，復合物穩定性為縱坐標，得出不同因素對復合物穩定性影響的數據圖。

2 結果與分析

2.1 體外模擬胃腸液pH值對復合物穩定性的影響

圖1 體外模擬胃液的pH值對復合物穩定性的影響Fig.1 Time-dependent effect of in vitro SGF pH on the stability of the complex

由圖1可知，體外模擬胃液pH值變化對復合物穩定性的影響較明顯。這可能是由于燕麥β-葡聚糖在酸性環境下易發生水解[9]以及低pH值導致β-葡聚糖構象發生變化引起的[23]。隨著孵育時間的變化，復合物逐漸解離，穩定性逐漸減弱。隨著胃液pH值增大，復合物穩定性逐漸增大。如在30 min時，pH值為4時復合物穩定性變化量是pH值為1.5時的3.44倍；在180 min時，前者是后者的2.79倍。說明pH值增大使得復合物的穩定性降低，即燕麥β-葡聚糖-EGCG復合物中隨著pH值的降低，復合物穩定性越高。參照之前的研究[16]，復合物兩者之間主要由于氫鍵作用相結合。在酸性條件下，氫離子濃度較高，有機物多以分子形式存在，分子形式有利于氫鍵的形成，所以在pH值越低的情況下越容易形成氫鍵，復合物越穩定。由于空腹下胃液的pH值為1.5左右，且進食會使得胃液的pH值增大[24]。可判斷在禁食狀態下復合物在胃液中相對進食狀態而言較穩定。此外，在孵育的前30 min，復合物穩定性變化最大，變化量均超過總變化量的50%以上。即在作用前30 min，模擬胃液對復合物穩定性影響最為顯著。物質在胃液中停留的時間一般為90 min左右[25]，但停留時間也會因條件發生改變。通過縮短復合物在胃液中停留的時間，可以減少復合物中EGCG的損失。由圖2可知，體外模擬腸液中pH值變化對復合物穩定性的影響較明顯。隨著時間的延長，復合物穩定性降低，即解離的EGCG量逐漸增大。隨著模擬腸液pH值增大，復合物穩定性逐漸降低。如在30 min時，pH值為8時復合物穩定性變化量是pH值為5時的2.48倍；在180 min時，前者是后者的2.02倍。由于兒茶素類在偏堿性條件下不穩定[26]，這可能是導致復合物穩定性降低的原因之一。由于進食會使得腸液pH值增大[24]，由此可推測在禁食狀態下復合物在腸液中的穩定性較高。

圖2 體外模擬腸液的pH值對復合物穩定性的影響Fig.2 Time-dependent effect of in vitro SIF pH on the stability of the complex

2.2 復合物質量濃度對其在體外模擬胃腸液中穩定性的影響

圖3 體外模擬胃液中復合物質量濃度對復合物穩定性的影響Fig.3 Time-dependent effect of the concentration of the complex on its stability in SGF in vitro

由圖3可知，體外模擬胃液中復合物質量濃度變化對復合物穩定性的影響顯著，其原因可能是燕麥β-葡聚糖在酸性環境下容易發生部分水解[24]，復合物質量濃度的提高，使得未發生水解的燕麥β-葡聚糖提高，由氫鍵與EGCG復合，復合物穩定性隨之提高。隨著孵育時間的變化，復合物逐漸解離，穩定性逐漸降低；隨著復合物質量濃度增加，復合物穩定性逐漸增大。如在30 min時，質量濃度為0.5 mg/mL時復合物穩定性變化量是質量濃度為1.0 mg/mL時復合物變化量的3.22倍；在180 min時，前者是后者的3.17倍。因此，增大復合物在模擬胃液中的含量，可以增大復合物在胃液中的穩定性。在孵育的前30 min，復合物穩定性變化量最大，變化量均超過總變化量的50%以上，減少復合物在胃液中的停留速度，有利于復合物的保留。孵育180 min后，復合物質量濃度高于0.8 mg/mL時，復合物穩定性大于80%，復合物得到較大程度的保存。適當提高復合物攝入量，對于其在胃液中的穩定性有積極的影響。

圖4 體外模擬腸液中復合物質量濃度對復合物穩定性的影響Fig.4 Time-dependent effect of the concentration of the complex on its stability in SIF in vitro

由圖4可知，體外模擬腸液中復合物質量濃度變化對復合物穩定性的影響顯著。隨著孵育時間的變化，復合物逐漸解離，穩定性逐漸降低；隨著復合物質量濃度增加，復合物穩定性逐漸增大。如在30 min時，質量濃度為0.5 mg/mL時復合物穩定性變化量是質量濃度是1.0 mg/mL時復合物變化量的3.79倍；在180 min時，前者是后者的4.04倍。說明復合物的穩定性隨著復合物質量濃度增大而增大。此外，同模擬胃液中相似，復合物質量濃度高于0.8 mg/mL時，復合物穩定性大于80%，復合物得到較大程度的保留，故適當提高復合物攝入量，對于其在腸液中的穩定性有積極的影響。

3 結 論

通過對復合物在體外模擬胃腸液中的穩定性進行研究。得出以下結論：1）pH值對復合物穩定性的影響：在模擬胃液和腸液中，隨pH值的升高，復合物穩定性逐漸降低。在孵育前期，復合物穩定性變化最顯著，孵育前30 min，穩定性變化量均超過總變化量的50%以上。對比模擬胃液和模擬腸液，模擬胃液對復合物穩定性影響大于模擬腸液。2）復合物質量濃度對復合物穩定性的影響：在模擬胃液和腸液中，隨復合物質量濃度的升高，復合物穩定性逐漸增大。復合物質量濃度高于0.8 mg/mL時，復合物穩定性在孵育時間內均可達到80%，復合物質量濃度的提高，使得其在模擬胃腸液中的穩定性提高。研究表明在模擬胃腸液中pH值和復合物質量濃度是影響復合物穩定性的重要因素，這為將來研探討β-葡聚糖-EGCG復合物的體內生物學作用提供一定的參考。

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in vitro Stability of the Complex of EGCG and Oat β-Glucan in Simulated Gastrointestinaltract Fluid

MA Ya-qin1, GAO Rui-ping1,2, LIU Jia1, ZHAO Guo-hua1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China; 3. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Chongqing 400715, China)

In this study, the stability of epigallocatechin gallate (EGCG)-oat β-glucan complex in simulated gastric (SGF) and intestinal (SIF) fluids was investigated.The complex was prepared by vacuum freeze-drying method. The effect of different concentrations of EGCG-oat β-glucan complex and different pH levels of SGF and SIF on its stability was investigated. Results showed that the complex was more stable at lower pH levels in both SGF and SIF. It could be stabilized during fasting because food ingestion results in higher pH levels in the gastrointestinal fluid. This complex at higher concentrations had better stability in both SGF and SIF, reaching above 80% after being incubated for 180 min at 0.8 mg/L. This indicates that the stability of the complex in the gastrointestinal fluid can be improved by appropriately increasing its concentration.

oat β-glucan; EGCG; complex; simulated gastrointestinal fluid; stability

TS201.2

A

1002-6630（2014）03-0033-04

10.7506/spkx1002-6630-201403007

2013-01-13

國家自然科學基金項目（31171654）

馬雅欽（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：mayaqin1990@126.com

*通信作者：趙國華（1971—），男，教授，博士，研究方向為非消化性碳水化合物化學與營養。E-mail：zhaoguohua1971@163.com