門靜脈高壓大鼠腸黏膜通透性改變時D-乳酸和內毒素的表達及復合膳食纖維的保護作用

喬小東 武 華

1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西醫科大學第一臨床醫學院普外科，山西太原 030001

門靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）是臨床一種常見病、多發病，為各種原因所致門靜脈血循環障礙而導致的一系列臨床綜合征，病死率較高，影響患者的生命質量，并對家庭和社會造成嚴重的負擔。其中門靜脈高壓性腸病[1]是其與腸道密切相關的臨床表現之一。 然而胃腸道又是體內最大的細菌儲存器官[2]，腸屏蔽功能受損后引發的腸道菌群易位是其繼發感染及膿毒癥的主要原因[3]。 因此如何進行腸屏蔽功能的檢測和保護將成為研究的重點。 有研究證明，復合膳食纖維在保持腸道形態結構、改善腸道黏膜功能方面發揮積極作用[4]。 本研究利用門靜脈高壓大鼠模型，通過對模型大鼠血漿D-乳酸和內毒素表達的測定，探尋復合膳食纖維對門靜脈高壓大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用，為其臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雌性Wistar 大鼠65 只，體重180～200 g，由山西醫科大學動物中心提供。 能全素（整蛋白型腸內營養粉劑，產品批號：121004）購自紐迪希亞制藥（無錫）有限公司。復合膳食纖維（可溶與不可溶性膳食纖維）購自無錫華瑞制藥有限公司。 D-乳酸試劑盒購自BioAssay Systems 公司。 鱟試劑盒（Ⅱ）購自上海伊華臨床醫學科技公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 健康雌性Wistar 大鼠65 只經0.35 g/L苯巴比妥溶液誘導1 周后，隨機抽取5 只大鼠設為對照組，其余60 只大鼠為實驗組。實驗組大鼠采用50%的CCl4橄欖油復合法建立門靜脈高壓模型：以0.4 mL/100 g 的劑量經背部皮下注射50%的CCl4橄欖油溶液，每周2 次，持續4 周；之后按0.5 mL/100 g 劑量同法注射，每周2 次，持續4 周，共8 周。第10 周隨機抽取2 只大鼠行門靜脈壓力測定及肝組織活檢。建模成功并存活的大鼠共40 只。 對照組大鼠以同法注射生理鹽水。

1.2.2 動物分組 將40 只門靜脈高壓大鼠模型隨機分成A、B、C、D 4 組，每組各10 只，各組按125 mL/（kg·d）劑量分四次（8 h 1 次）給予不同的腸內營養制劑。 A組給予生理鹽水；B 組給予不含膳食纖維的能全素；C組給予能全素+復合膳食纖維20 g/L （可溶與不可溶之比為1∶2）；D 組給予能全素+復合膳食纖維20 g/L（可溶與不可溶之比為2∶1）。對照組行正常飼養，各組大鼠飼養期間自由飲水。

1.3 檢測指標

實驗組4 組大鼠分別于飼養的第1、3、7 天中相同的時間點隨機抽取3、3、4 只大鼠行麻醉后開腹，使用采血針穿刺門靜脈取全血2 mL 置于肝素抗凝管內，低溫離心后，吸取上清液，于-20℃保存；門靜脈取血后，行腹主動脈穿刺，用加有肝素的試管留取血4～5 mL，低溫離心后，吸取上清液1 mL，于-20℃保存；在距盲腸10～12 cm 處剪取2 cm 末端回腸組織，在10%的中性甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋留作標本。對照組大鼠于飼養的第7 天以同法取血及組織標本。 取材后采用頸椎脫臼法處死相應大鼠。

1.3.1 病理形態學觀察 每只大鼠的石蠟標本，以4 μm厚度垂直切片，經HE 染色后在光鏡下觀察回腸黏膜上皮細胞結構。

1.3.2 D-乳酸含量測定 采用改良的酶學分光光度法測定血漿中D-乳酸活性[5]。

1.3.3 血漿內毒素測定 采用鱟試劑偶氮顯色法測定內毒素濃度，過程嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0 對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。 以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組形態學觀察

實驗組大鼠各時相回腸黏膜均出現明顯的黏膜萎縮，絨毛萎縮變短，黏膜固有層水腫，腺體排列稀疏，中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，部分黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，黏膜下層充血水腫及出血顯著。 對照組回腸黏膜上皮結構完整。實驗組中各時相B、C、D組均較A 組腸黏膜的損傷輕，其中B 組在7 d 時較同時相的A 組回腸黏膜的損傷有所改善，C、D 組在3 d和7 d 較同時相的B 組回腸黏膜的損傷有所改善但未能完全恢復至對照組水平。

2.2 各組血漿D-乳酸表達及含量

實驗組四組大鼠血漿D-乳酸表達在建模后各時相與對照組[（2.13±0.39）mg/L]比較，差異均有統計學意義（P < 0.05），各組隨時間變化的曲線方向基本一致。 建模后1 d 四組組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；3、7 d 四組組間比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01），且3、7 d 各時相B、C、D 組大鼠血漿D-乳酸表達分別與A 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），3、7 d 各時相C、D 組分別與B 組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05），各時相D 組與C 組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠血漿D-乳酸測定結果（mg/L，±s）

表1 各組大鼠血漿D-乳酸測定結果（mg/L，±s）

注：與A 組比較，*P < 0.05；與B 組比較，#P < 0.05；與C 組比較，&P <0.05

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2.3 各組血漿內毒素表達及含量

實驗組四組大鼠血漿內毒素表達在建模后各時相與對照組[（0.21±0.02）EU/mL]比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。 建模后1 d 四組組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；3、7 d 四組組間比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01），且3、7 d 各時相B、C、D 組大鼠血漿內毒素表達分別于A 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），3、7 d 各時相C、D 組分別于B 組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05），各時相D組與C 組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠血漿內毒素測定結果（EU/mL，±s）

表2 各組大鼠血漿內毒素測定結果（EU/mL，±s）

注：與A 組比較，*P < 0.05；與B 組比較，#P < 0.05；與C 組比較，&P <0.05

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3 討論

腸黏膜屏障主要由機械屏障、生物屏障、化學屏障及免疫屏障組成[6-8]。通過大量的動物實驗和臨床試驗研究證實，在腸黏膜缺血、再灌注損傷、營養不良及應激性損傷等原因下，均可引起腸黏膜損傷、萎縮、通透性增加、 菌群失調等表現的腸黏膜屏障功能障礙。腸屏障功能障礙可導致細菌和（或）內毒素易位，并可誘發和（或）加重全身炎性反應和多器官功能障礙[9]。

本研究通過對門靜脈高壓大鼠模型的回腸黏膜組織進行形態學觀察并對血漿D-乳酸和內毒素指標的表達進行檢測，結果表明：①實驗組門靜脈高壓大鼠模型的回腸黏膜有明顯的萎縮，絨毛萎縮變短，黏膜固有層水腫，中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，部分黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，黏膜下層充血水腫及出血顯著。 而對照組回腸黏膜上皮結構完整。 提示腸黏膜屏障功能受損。②實驗組門靜脈高壓大鼠模型的血漿D-乳酸和內毒素的表達均明顯高于對照組，提示通過建立門靜脈高壓模型后大鼠腸黏膜明顯受損，腸黏膜屏障功能障礙。當腸道發生急性缺血等損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，腸黏膜通透性增加時，腸道中細菌產生大量D-乳酸通過受損黏膜入血，使血漿D-乳酸水平升高，故檢測血漿D-乳酸水平可及時反映腸黏膜損害程度和通透性變化[10]。 正常情況下機體腸腔內含有大量細菌和內毒素，當腸屏障功能障礙時，內毒素通過腸黏膜，進入血循環，形成內毒素血癥，因此監控外周血中的內毒素水平，成為了解腸屏障功能的重要手段[11]。

腸內營養在防止腸黏膜萎縮、維護腸黏膜機械及免疫屏障、防止細菌易位的發生其重要作用[12]。 膳食纖維是植物中的可食用部分或類似的碳水化合物，雖然不能在小腸內被降解， 但可以在結腸內被細菌酵解[13]。 膳食纖維又可分為可溶性和不可溶性兩類。 不可溶性膳食纖維作為植物細胞壁的纖維成分，在腸道內可吸收水分、有害菌群和毒素，還可以增加腸道的蠕動[14]。 可溶性膳食纖維在進入結腸后能被盲腸和結腸內的厭氧菌分解成為短鏈脂肪酸，能直接供給結腸黏膜細胞75%以上的能量[15]。 本研究中加復合膳食纖維的C、D 組較未加復合膳食纖維的A、B 組腸黏膜損傷明顯有所改善，血漿D-乳酸和內毒素的表達呈顯著下降趨勢。 結果顯示，復合膳食纖維對門靜脈高壓大鼠的腸黏膜屏障功能有保護作用。

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