響應面法優(yōu)化蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸的提取工藝

謝 瑋，嚴守雷，李春麗，王清章，李 潔

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 4300 7 0）

響應面法優(yōu)化蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸的提取工藝

謝 瑋，嚴守雷*，李春麗，王清章，李 潔

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 4300 7 0）

為從蓮藕中提取出結(jié)合態(tài)阿魏酸，首先用質(zhì)量分數(shù)75%乙醇除去蓮藕中游離態(tài)阿魏酸，再用Na OH溶液提取結(jié)合態(tài)阿魏酸，紫外分光光度法在324 nm波長處測定其含量。通過單因素試驗對影響結(jié)合態(tài)阿魏酸提取的4個因素即NaOH濃度、提取溫度、提取時間、液固比進行初步優(yōu)化分析，再通過Box- Behnken試驗設(shè)計和響應面優(yōu)化最終提取條件。結(jié)果表明：NaOH溶液濃度1.49 mol/L、提取時間2.66 h、提取溫度84.45℃、 液固比5.5：1（mL/g）為最佳提 取工藝，在此條件下，蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率為0.217 mg/g（以干質(zhì)量計）。

蓮藕；提取；結(jié)合態(tài)阿魏酸；比色法；響應面法優(yōu)化

阿魏酸是植物中苯丙氨酸和酪氨酸生物合成木質(zhì)素的代謝產(chǎn)物之一[1]，是一年生植物中細胞壁的重要成分[2]，在 植物組織中有兩種形態(tài)：游離態(tài)阿魏酸和結(jié)合態(tài)阿魏酸。在大多數(shù)果蔬中，阿魏酸以結(jié)合態(tài)羥基酸形式存在，在根類蔬菜和谷物中，阿魏酸二聚體通過酯鍵與阿拉伯糖和半乳糖殘基共價交聯(lián)，存在于果膠或纖維多糖中[3]。單子葉植物，尤其是禾本科植物細胞壁中含有阿魏酸，在一些雙子葉植物如菠菜（Spinacia oleracea L.）、甜菜（Beta vulgaris）和仙人掌目（Cactales）中也含有[4]。阿魏酸有很多有益的生理功效，如抗氧化、抗血栓和防癌[5]。這種生物活性的化合物含有羥基和羧基，能與其他物質(zhì)反應[6-7]，除了對植物生長的抑制作用外，阿魏酸作為合成木質(zhì)素的成分，還可以滅活植物病毒，其毒性可以作為抗生素[8]。阿魏酸還能防止動物細胞受到X射線和致癌物質(zhì)的侵害[9]，可以抗肝毒素[10]，且對心血管系統(tǒng)有益[11]。總之，阿魏酸在食品、藥品以及化妝品行業(yè)都有廣泛應用[12-14]。

細胞壁多糖在果膠代謝作用下使果蔬表現(xiàn)不同的質(zhì)地口感，白蘆筍貯藏過程中細胞壁多糖發(fā)生阿魏酸酯化交聯(lián)，引起木質(zhì)化現(xiàn)象，隨著酚類物質(zhì)增加，其硬度上升。在荸薺、甜菜中都證實了過氧化物酶催化果膠阿魏酸交聯(lián)，增強植物源性果蔬的硬度[15-17]。蓮藕粉脆質(zhì)地與品種、栽培條件、采收期等因素有關(guān)，阿魏酸在細胞壁上與多糖的交聯(lián)程度，即結(jié)合態(tài)阿魏酸的含量 可能是影響其粉脆質(zhì)地的關(guān)鍵因素。阿魏酸常用的測定方法有高效液相色譜法、薄層掃描法、分光光度計法[18]。相對而言，比色法可快速大量、較準確的測定阿魏酸含量[19]。本研究用NaOH提取蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸，采用單因素試驗和響應面優(yōu)化工藝條件，旨在為蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸含量測定提供一種較為快速、準確的方法，為找到蓮藕粉脆質(zhì)地的機理提供理論基礎(chǔ)，對蓮藕資源的進一步開發(fā)利用具有積極意義。

1 1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄂蓮4號，由湖北省武漢市蔬菜科學研究所提供，采收時間為2013年1月；鹽酸、無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；阿魏酸標品 阿拉丁化學有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 德國Sartorius Corporation公司；恒溫磁力攪拌水浴鍋 江蘇省金壇市漢康電子有限公司；紫外-可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；2005型低速離心機 常州國華電器有限公司；真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

蓮藕→洗凈、去皮、切塊→真空冷凍干燥→磨粉→PA袋抽真空密封包裝→-20℃低溫避光貯藏，待用→質(zhì)量分數(shù)75%乙醇提游離阿魏酸（液固比12：1（mL/g），45 ℃水浴，1 h）→紗布過濾，取濾渣→加30 mL 0.5% α-淀粉酶、10 mL 質(zhì)量分數(shù)0.1%木瓜蛋白酶（60 ℃水浴，1 h）→滅酶（100 ℃水 浴，10 min）→加5 mL 0.2 g/L Na2SO3→NaOH溶液提結(jié)合態(tài)阿魏酸（NaOH濃度、提取時間、提取溫度、液固比按梯度）→紗布過濾，取濾液→4 mol/L鹽酸調(diào)pH值到2左右→4 000 r/min離心10 min，取上清液→乙酸乙酯萃取（20 mL，1 h，萃取兩次）→“合并乙酸乙酯相”改為“合并乙酸乙酯相”→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干→質(zhì)量分數(shù)75%乙醇定容→紫外分光光度計324 nm比色。

1.3.2 阿魏酸含量的測定

稱取0.010 g阿魏 酸標品，用質(zhì)量分數(shù)75%乙醇定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的阿魏酸標準液。分別移取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL標準液到100 mL容量瓶中，用質(zhì)量分數(shù)75%乙醇定容，在324 nm處測定吸光度。每個質(zhì)量濃度做3次平行，取平均值，繪制標準曲線，得到吸光度與阿魏酸溶液質(zhì)量濃度（A，mg/mL）之間的回歸方程為：A=81.6C-0.064 8，R2=0.999 8，說明在所取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度成良好的線性關(guān)系。

式中：C為阿魏酸的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為溶液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.5軟件，響應面優(yōu)化設(shè)計及數(shù)據(jù)處理采用Design Expert V8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 NaOH濃度對阿魏酸提取率的影響

固定提取溫度80 ℃、提取時間2 h、液固比10：1（mL/g），考察NaOH濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol/L對蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 NaOH濃度對結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響Fig.1 Effect of alkali concentration on the yield of bound ferulic acid

適當?shù)腘aOH濃度可破壞酯鍵，使阿魏酸釋放游離，體系中阿魏酸含量增加。由圖1可知，當NaOH濃度大于1.25 mol/L時，可能是由于NaOH濃度過高，阿魏酸被氧化破壞，提取率降低[20]。

2.1.2 液固比對阿魏酸提取率的影響

固定提取溫度80 ℃、提取時間2 h、NaOH濃度1.25 mol/L，考察液固比分別為4：1、6：1、8：1、10：1、12：1、14：1（mL/g）對蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 液固比對結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of bound ferulic acid

阿魏酸在蓮藕中以酯鍵與細胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)，由圖2可知，適當?shù)腘aOH溶液可破壞酯鍵，使阿魏酸釋放游離，當液固比大于6：1（mL/g）時，可能是由于NaOH溶液體積過大，使提取液黏度增大，不利于阿魏酸釋放，提取率降低。

2.1.3 提取溫度對阿魏酸提取率的影響

固定提取時間2 h、NaOH濃度1.25 mol/L、液固比6：1 （mL/g），提取溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃對蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of bound ferulic acid

隨著溫度的升高，與阿魏酸結(jié)合的酯鍵斷裂的速度增加，提取量也逐漸增加。由圖3可知，當溫度超過80 ℃，可能是由于阿魏酸自身發(fā)生中和反應，生成阿魏酸的多聚體；且在高溫作用下阿魏酸發(fā)生分解反應或與提取液中的其他物質(zhì)化合，致使溶液中阿魏酸含量降低[21]。

2.1.4 提取時間對阿魏酸提取率的影響

固定提取溫度80 ℃、NaOH濃度1.25 mol/L，液固比6：1（mL/g），提取時間分別0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h對蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of bound ferulic acid

隨著提取時間的延長，阿魏酸逐漸由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，提取量逐漸增加。由圖4可知，當提取時間超過3 h后，可能是時間過長導致阿魏酸被氧化破壞，提取率降低。

2.2 加標回收率實驗

根據(jù)已知樣品中結(jié)合態(tài)阿魏酸的含量，在萃取前加入一定量的阿魏酸標品，按上述方法分別測3 次，一式3 份，計算加標回收率。

由表1可知，平均加標回收率達到95.93%，說明該分析方法和測量系統(tǒng)準確性較高，可行性強。

表1 加標回收率實驗（n=3）Table1 Recovery rates of ferulic acid from spiked sample （n=3）

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面因素的選取

綜合單因素試驗結(jié)果，利用Box-Behnken Design 建立數(shù)學模型，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對阿魏酸提取工藝的主要影響因素進行優(yōu)化試驗，選取提時間（A）、提取溫度（B）、NaOH濃度（C）、液固比（D）為4 個因素自變量，每個因素選取3 個顯著水平，結(jié)合前期單因素試驗結(jié)果，設(shè)定響應面因素水平和編碼，見表2。

表2 響應面試驗的因素水平和編碼值Table2 Coded factors and levels in quadratic regression rotational combinational design

2.3.2 響應面分析試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果

選取提取時間（A）、提取溫度（B）、NaOH濃度（C）、液固比（D）為自變量，以阿魏酸提取率（Y）為因變量，共設(shè)立29 個處理組，進行響應面分析試驗，結(jié)果見表3。

表3 響應面分析方案及試驗結(jié)果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.3 多元二次響應面回歸模型的建立

對表3實驗結(jié)果通過SAS軟件程序進行二次回歸響應分析，得到阿魏酸含量的預測值對編碼自變量反應的多元二次響應面回歸模型如下：

Y=0.19＋4.757×10-3A＋0.019B＋0.043C-1.132×10-3D-0.010AB＋0.011AC＋3.958×10-3AD＋7.923×10-3BC＋2.600×10-3BD-0.012CD-0.013A2-0.025B2-0.029C2-0.010D2

對此回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 二次響應面回歸模型方差分析Table4 Analysis of variance for the developed regression equation

由表4可知，該模型P＜0.01，回歸模型達極顯著水平，而誤差不顯著，二次多項式相關(guān)系數(shù)R2=88.47%，調(diào)整相關(guān)系數(shù)=76.05%，說明該模型擬合度較好，因此可用此模型對響應面進行分析和預測。通過比較方程一次項系數(shù)絕對值大小，可以判斷因子影響主次性，在本實驗工藝參數(shù)中，影響結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率最主要的因素是NaOH濃度和提取溫度，達到極顯著水平，其次是提取時間和液固比，影響不顯著。

2.3.4 阿魏酸提取率響應面分析與優(yōu)化

圖5 兩因素交互作用對結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of extraction parameters on the yield of bound ferulic acid

利用Design Expert V8.0.6軟件進行二次多元擬合得到二次回歸方程的響應面曲線，在兩因素條件固定不變的情況下，考察各因素交互作用對阿魏酸提取率（Y）的影響，所得響應面如圖5所示。

對兩因素交互作用影響阿魏酸提取率進行分析和評價，從中確定最佳因素水平。由圖5可知，各兩因素對阿魏酸提取率的影響均成拋物線形，即隨著NaOH濃度、提取溫度、提取時間、液固比的同時增大，結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率呈先增大后降低的趨勢，因此在提取工藝中適當增加各因素值可以提高得率，但需要控制各因素在最佳范圍。以阿魏酸的提取率為響應值，通過旋轉(zhuǎn)設(shè)計結(jié)果分析后，確定最佳提取工藝為提取時間2.66 h、提取溫度84.45 ℃、NaOH濃度1.49 mol/L、液固比5.5：1（mL/g），在此條件下，預測蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率為0.214 mg/g（以干質(zhì)量計）。

2.3.5 響應面預測最優(yōu)條件與驗證

為檢驗響應面優(yōu)化阿魏酸提取工藝的可靠性，采用優(yōu)化后的提取工藝條件進行驗證實驗，得到實際提取率為（0.217±0.011）mg/g（以干質(zhì)量計），與模型預測值的相對誤差為1.14%，說明運用響應面優(yōu)化法得到的模型參數(shù)準確可靠。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗選出4 個因素的3 個顯著水平，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對阿魏酸提取工藝進行優(yōu)化，利用Box-Behnken和統(tǒng)計學方法建立阿魏酸提取率的數(shù)學模型，利用Design Expert V8.0.6軟件進行二次多元擬合得到響應面曲線。實驗得出，影響結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率的因素按主次順序為NaOH濃度＞提取溫度＞提取時間＞液固比，最佳提取工藝為提取時間2.66 h、提取溫度84.45 ℃、NaOH濃度1.49 mol/L、液固比5.5：1（mL/g），在此條件下，阿魏酸與木質(zhì)素交聯(lián)的酯鍵斷裂，結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)程度最高，且阿魏酸被氧化破壞的程度最低，在此條件下，蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸提取率最高，達0.217 mg/g（以干質(zhì)量計算）。實驗結(jié)果與模型最優(yōu)化理論值相對誤差為1.14%，說明響應面優(yōu)化所得參數(shù)可靠，工藝可行。

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Optimization of Alkaline Hydrolysis of Lotus Root for Bound Ferulic Acid by Response Surface Methodology

XIE Wei, YAN Shou-lei*, LI Chun-li, WANG Qing-zhang, LI Jie
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this wo rk, bound ferulic acid (FA) was extracted from lotus root with NaOH solution following the removal of free FA with 75% ethanol solution. FA content was spectrometrically determined at 324 nm, where it had characteristic absorption. A preliminary investigation into four ext raction parameters including NaOH concentration, temperature, extraction time and solv ent-to-solid ratio was carried out by one-factor-at-a-time design. By using Box-Behnken design and response surface analysis, the optimal extraction conditi ons were establ ished as follows: NaOH concentration,1.49 mol/L; extraction time, 2.66 h; extraction temperature, 84.45 ℃, and solvent-to-solid ratio, 5.5:1 (mL/g). Under the optimized conditions, the yield of found FA from lotus root was 0.217 mg/g (by dry weight).

lotus root; extraction; bound ferulic acid; colorimetric method; response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630（2014）10-0018-05

10.7506/spkx1002-6630-201410004

2013-08-01

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B03）

謝瑋（1990—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：xiewei_hzau@163.com

*通信作者：嚴守雷(1975—)，男，副教授，博士，研究方向為水生蔬菜加工與保鮮。E-mail：yanshoulei1225@gmail.com