利用核磁共振法定量分析植物油中多種脂肪酸及水含量

李添寶，吳 越，羅 敬

利用核磁共振法定量分析植物油中多種脂肪酸及水含量

李添寶，吳 越，羅 敬

（湖南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

采用核磁共振波譜分析技術(shù)，歸屬了植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸甘油酯、飽和脂肪酸甘油酯及水的核磁共振質(zhì)子譜的主要特征峰。在無(wú)需預(yù)處理?xiàng)l件下，以苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)植物油中各種脂肪酸及水進(jìn)行定量分析，加標(biāo)回收率可達(dá)98%～102%。亞麻酸、亞油酸、油酸、總飽和脂肪酸、水的精密度分別為0.11%、0.12%、0.68%、0.70%、2.65%。該法取樣量少、無(wú)需昂貴的標(biāo)樣，可直接快速定量，結(jié)果準(zhǔn)確，可為植物油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一種簡(jiǎn)單可行的新方法。

核磁共振；不飽和脂肪酸；飽和脂肪酸；水

市場(chǎng)上常見(jiàn)的植物油主要是由多種不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸混合脂肪酸的甘油酯組成，在測(cè)定植物油里各脂肪酸含量的方法中，最常用的方法有氣相色譜法[1-4]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-8]，但這些方法存在許多問(wèn)題，比如：測(cè)定之前繁瑣的甲酯化預(yù)處理，長(zhǎng)鏈碳的酯不容易氣化，不飽和脂肪酸酯的熱不穩(wěn)定性，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)樣品的昂貴等，這些都造成了在檢測(cè)食用油中脂肪酸時(shí)步驟繁多，樣品用量大，耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果也不一定準(zhǔn)確。

目前，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）定量分析植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸、總飽和脂肪酸以及水含量的方法研究很少[9-15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)核磁共振技術(shù)，在對(duì)原料無(wú)需任何預(yù)處理的情況下，通過(guò)分析各種植物油的1H-NMR譜，歸屬了植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸以及水等的質(zhì)子特征峰，并且以苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定了以上各種物質(zhì)的含量及方法的精密度，通過(guò)加標(biāo)回收率驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。同時(shí)增加對(duì)比實(shí)驗(yàn)，利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀檢測(cè)各種植物油，通過(guò)面積歸一化法測(cè)出各植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸和飽和脂肪酸的含量，也驗(yàn)證了該方法準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 種常見(jiàn)植物油（紫蘇籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油、橄欖油、玉米油、花生油、茶油、葵花籽油）、氘代氯仿 青島騰龍微波科技有限公司；苯甲酸 成都化學(xué)試劑廠；油酸甲酯 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、甲醇、苯（均為分析純） 湖南師范大學(xué)化學(xué)試劑廠；無(wú)水Na2SO4（分析純） 上海山浦化工有限公司；石油醚（60～90 ℃、分析純）、KOH（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaHSO4（自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE 500 MHz超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振儀 瑞士Brüker公司；5 mm核磁共振樣品管、電子分析天平、GC/MS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司；電熱干燥箱 武漢市無(wú)線電元件廠；恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司；電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；自動(dòng)雙重純水蒸餾器 上海亞太技術(shù)玻璃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的1H-NMR測(cè)定

由于市場(chǎng)上無(wú)法購(gòu)買到純的三亞麻酸甘油酯、三亞油酸甘油酯、三油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，但亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯和油酸甲酯與其對(duì)應(yīng)的脂肪酸甘油酯化學(xué)位移基本相同，故實(shí)驗(yàn)選取了油酸甲酯標(biāo)樣、以及自制的亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯樣品對(duì)各種不飽和脂肪酸甘油酯的質(zhì)子峰進(jìn)行了歸屬。

稱取約70 mg植物油至5 mm的核磁共振樣品管中，再加入約0.6 mL氘代氯仿，用于繪制植物油的核磁譜圖。

將制好的樣品充分振搖，每次測(cè)定都進(jìn)行調(diào)諧、勻場(chǎng)；測(cè)定條件控制在：溫度297.3 K；500 MHz核磁共振儀的頻率500.13 MHz；氫譜譜寬10 330.578 Hz；掃描16 次；空掃2 次；每個(gè)核磁樣品管測(cè)量6 次；譜圖處理時(shí)以四甲基硅烷定位。

1.3.2 各種脂肪酸及水的含量測(cè)定

分別稱取約70 mg 9 種植物油，分別添加約18 mg苯甲酸，充分搖勻后待測(cè)。

1.3.3 回收率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)的添加物來(lái)測(cè)定方法的回收率。

選取其中1 種食用油（大豆油），稱取約70 mg，添加約28～78 mg油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，約18 mg苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)，充分搖勻后待測(cè)。

1.3.4 精密度測(cè)定

選取其中1 種食用油（大豆油），稱取約70 mg，添加約18 mg苯甲酸，充分搖勻后測(cè)量6 次。

1.3.5 利用GC-MS測(cè)定植物油中各種脂肪酸的含量

取食用油10 g于平底燒瓶中，加入0.4 mol/L KOHCH3OH溶液；于60 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌回流1 h，至溶液澄清；待冷卻到室溫后加入NaHSO4溶液，調(diào)至pH值為2～3；溶液分層，用分液漏斗分出上層油相。

將上層油相物轉(zhuǎn)移到三頸燒瓶中，加入2 g NaHSO4固體，少量水將其溶解，2 mL苯，20 mL甲醇；三頸瓶口分別裝上溫度計(jì)、分水器，磨口塞；然后將三頸瓶放置恒溫磁力攪拌器上加熱攪拌，保持反應(yīng)物微沸，加熱回流1 h，直到分水器中水液面不再上升即可；將生成物冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，蒸餾水洗滌5～6 次，石油醚萃取上層油相，用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾后放入烘箱中烘干溶劑，得到混合脂肪酸甲酯；最后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)得到總離子流圖。

色譜柱：Rtx-wax 彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：柱溫100 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；初始溫度100 ℃保持1min，以15 ℃/min升到175 ℃保持12 min；再以2 ℃/min升到245 ℃保持2 min；離子源溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；不分流；柱前壓67.9 kPa；質(zhì)量掃描范圍33～500 u；溶劑延遲時(shí)間3.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸甘油酯1H-NMR譜特征峰的確認(rèn)

植物油中不飽和脂肪酸甘油酯主要成分為亞麻酸、亞油酸、油酸和飽和脂肪酸混合脂肪酸的甘油酯，對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)和化學(xué)位移（圖1）。

圖1 脂肪酸甘油酯結(jié)構(gòu)及化學(xué)位移Fig.1 Structures and chemical shifts of fatty acids

其中脂肪酸部分按照從左到右依次給氫原子號(hào)為1～8，化學(xué)位移相同的H編號(hào)一致，由于1 mol甘油醇只能結(jié)合3 mol脂肪酸，故圖中總飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)未畫出，但其化學(xué)位移類似，只有2.25、1.60、1.29、0.854組峰。以紫蘇籽油為例，來(lái)確認(rèn)其1H-NMR譜中各脂肪酸的特征峰（圖2）。

圖2 紫蘇籽油的1H--NMR譜Fig.21H-NMR spectrum of perilla seed oil

紫蘇籽油中從高場(chǎng)到低場(chǎng)分別為：δ=5.32歸屬為所有脂肪酸中雙鍵上的5號(hào)H；δ=5.30為甘油醇上次甲基的H；δ=4.29和δ=4.14歸屬為甘油醇上亞甲基的2 個(gè)H；δ=2.78歸屬為亞油酸和亞麻酸上位于2 個(gè)—C=C雙鍵之間的亞甲基6號(hào)H；δ=2.25歸屬為和—C=O直接相連的亞甲基上的1號(hào)H；δ=2.02歸屬為與—C=C雙鍵相鄰的亞甲基上的4號(hào)H；δ=1.60歸屬為與—C=O相隔一個(gè)—CH2的亞甲基上的2號(hào)H，其油中微量水的質(zhì)子峰也在該處；δ=1.29為—CH2上的3號(hào)H；因?yàn)槭艿诫p鍵個(gè)數(shù)的影響，δ=0.96歸屬為亞麻酸末端—CH3上的7 H，而δ=0.85為其余的脂肪酸末端—CH3上的8號(hào)H[16]。

芝麻油、大豆油、菜籽油、橄欖油、玉米油、花生油、茶油、葵花籽油1H-NMR圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 8 種植物油的1H--NMR譜Fig.31H-NMR spectra of eight kinds of vegetable oils

2.2 脂肪酸及水含量的計(jì)算

利用吸收峰面積與氫質(zhì)子數(shù)成正比，通過(guò)加入苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)能準(zhǔn)確算出亞麻酸、亞油酸、油酸、飽和脂肪酸及水的含量。根據(jù)上述對(duì)各質(zhì)子峰的歸屬，可以看出δ=0.96的7號(hào)H的為亞麻酸末端—CH3的特征峰；δ=2.78的6號(hào)H包含了亞油酸和亞麻酸；δ=5.32的5號(hào)H包含了油酸、亞油酸和亞麻酸。

按公式（1）計(jì)算亞麻酸的峰面積：

按公式（2）計(jì)算亞油酸的峰面積：

按公式（3）計(jì)算油酸的峰面積：

按公式（4）計(jì)算所含水的峰面積：δ=1.60的峰面積為6 個(gè)2號(hào)H的面積和微量水的氫的面積之和，所以總面積減去6后，剩下的為水的峰面積。

式中：mS為樣品質(zhì)量/g；AS為樣品質(zhì)子吸收峰面積；nS為樣品吸收峰所包含質(zhì)子數(shù)；mR為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量/g；AR內(nèi)標(biāo)物吸收峰面積；nR為內(nèi)標(biāo)物吸收峰所包含質(zhì)子數(shù)；MS為樣品摩爾質(zhì)量/（g/mol）；MR為內(nèi)標(biāo)物摩爾質(zhì)量/（g/mol）；S為脂肪酸；R為苯甲酸。

按公式（8）、（9）計(jì)算各種植物油中各脂肪酸及水的含量：

根據(jù)上述計(jì)算方法，分別計(jì)算出各種植物油中各脂肪酸及水的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 植物油中各種脂肪酸及水的含量Table 1 Contents of fatty acids and water in vegetable oils %

從表1得到，在常見(jiàn)的植物油里紫蘇籽油中亞麻酸和飽和脂肪酸含量最高，葵花籽油中亞油酸最高，茶油中油酸含量最高，其中大豆油中水的含量最高。

2.3 回收率

稱取大豆油約70 mg，分別添加28.2、62.4、77.5 mg油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，約18 mg苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)，充分搖勻后測(cè)定，通過(guò)計(jì)算油酸甲酯的量與實(shí)際添加的量進(jìn)行比較，得出回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests

3 次測(cè)得的回收率分別為98.26%、101.81%、98.23%，回收率較高，表明該方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)量出樣品的含量，結(jié)果可靠。

2.4 精密度

表3 精密度計(jì)算結(jié)果Table 3 Results of precision tests

由表3可以得出，各種脂肪酸和水含量的精密度均小于3%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度較好。

2.5 GC-MS檢測(cè)各種植物油脂肪酸的含量

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述核磁方法的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)還利用GC-MS手段，通過(guò)面積歸一化法對(duì)各種植物油中的飽和與不飽和脂肪酸的含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 植物油中各種脂肪酸的含量Table 4 Contents of fatty acids in vegetable oils %

從表4可以看出，采用GC-MS手段通過(guò)面積歸一化法得到的各種脂肪酸含量與表2中核磁結(jié)果相差不大，說(shuō)明利用核磁共振儀加入內(nèi)標(biāo)的方法檢測(cè)植物油中亞麻酸甘油酯、亞油酸甘油酯、油酸甘油酯和飽和脂肪酸甘油酯的含量結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

核磁共振法測(cè)定植物油中脂肪酸含量的方法不僅避免了傳統(tǒng)氣相色譜檢測(cè)法中繁瑣的前處理和色譜條件的摸索，且在定量分析中可以快速計(jì)算出其中各種脂肪酸和水的含量[17-20]。其中的回收率和精密度都在允許范圍內(nèi)，為研究脂肪酸含量的測(cè)定提供了有效可靠的新方法。

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Quantitative Analysis of Fatty Acids and Water in Vegetable Oils by Nuclear Magnetic Resonance

LI Tian-bao, WU Yue, LUO Jing
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal Uinversity, Changsha 410081, China)

The main characteristic peaks of linolenic, linoleic, oleic acid, saturated fatty acids and water in vegetable oils were analyzed by1H-NMR spectroscopy. Benzoic acid was selected as an internal standard to quantify the contents of linolenic, linoleic, oleic acid, saturated fatty acids and water in vegetable oils by this method without any pretreatment. The recoveries were 98%-102% with RSD of 0.11%, 0.12%, 0.68%, 0.70% and 2.65% for linolenic, linoleic, oleic acid, total saturated fatty acids and water, respectively. The contents of linolenic, linoleic, oleic acid, total saturated fatty acids and water can be determined directly and accurately with less sample consumption and without using expensive standards. This new method is simple and applicable for studying quality standards for vegetable oils.

nuclear magnetic resonance (NMR); unsaturated fatty acid; saturated fatty acids; water

O65

A

1002-6630（2014）16-0212-05

10.7506/spkx1002-6630-201416041

2013-10-21

李添寶（1965—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯V與波譜分析。E-mail：ltbsir@yahoo.com.cn