超高效合相色譜法直接檢測VC方法

劉倩倩，周 圍,,,*，王 波，王麗婷，楊盛鑫

超高效合相色譜法直接檢測VC方法

劉倩倩1，周 圍1,2,3,*，王 波2，王麗婷3，楊盛鑫3

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，甘肅 蘭州 730000；3.西北師范大學地理與環境科學學院，甘肅 蘭州 730070）

建立超高效合相色譜法分離和測定VC的方法。超高效合相色譜技術集合超臨界流體色譜和超高效液相色譜的技術優點，流動相以CO2為主體，甲醇（含0.05% H3PO4）為助溶劑。選用Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流速0.6 mL/min，檢測波長為245 nm，方法檢出限為1.5 mg/kg，線性范圍為5～200 mg/L；加標回收率范圍為96.05%～101.15%；相對標準偏差為0.52%～0.76%，具有高效、檢測速度快、操作簡單、靈敏度高、檢出限低、重復性好、實驗成本低等優點。

超高效合相色譜；VC；測定；食品

VC又叫L-抗壞血酸，屬于水溶性維生素，具有較強的還原作用，參與體內氧化還原反應，是維持人體正常生理代謝不可缺少的一類有機化合物[1]。醫學研究還發現它不但具有生理活性，而且在人體內能夠阻止亞硝胺的形成，具有一定的防癌作用，增加機體對傳染病的抵抗力，對肝炎、肝硬變有療效[2-6]。同時又是一種理想的食品抗氧化劑。但是人體本身不能合成，必須依靠膳食供給，VC廣泛存在于新鮮的水果、蔬菜中[7-9]。因此建立準確測定VC含量的方法有著非常重要的現實意義。

VC測定的方法一般有碘量法[10]、比色法[11]、電位法[12]、紫外分光光度法[13]、熒光法[14]等，這些方法選擇性較差，容易受其他還原性成分、丙酮酸 和糖等成分的干擾，所需試劑較多、操作繁瑣[15]。近年來高效液相色譜法發展迅速，它具有高效、快速等特點，但是在實驗過程中有機溶劑耗費多，實驗成本較高，并對環境或多或少造成一定的污染。眾多文獻均在傳統的反相液相色譜中對VC進行分離分析，由于VC本身具有較高極性而導致保留時間較短，嚴重影響到VC的準確定量。采用超高效合相色譜法對VC進行直接檢測的方法卻鮮有報道，超高效合相色譜除了具有傳統超高效液相色譜所具有的優點外，還與超臨界流體色譜技術進行結合，以超臨界流體CO2為流動相主體，依靠流動相的溶劑化能力來進行分離、分析的色譜過程[16-17]。加之亞2 μm填料技術，能夠通過精確地調節流動相強度、壓力和溫度，獲得所需的系統分辨率和選擇性，對待測物的保留和分離進行有效調控，具有操作溫度低，有機溶劑使用量少、靈敏度高、重復性好、分析速度快等優點[18-21]。超臨界流體是指物質高于其臨界溫度和臨界壓力時的一種物態，它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低黏度、液體的高密度、以及介于氣液體之間的擴散系數的特征[22]。VC在紫外波長245 nm處有特異性吸收峰，樣品經均質、稀釋、過膜后，直接檢測食品中的VC，可通過保留時間定性，峰面積定量。本實驗通過系統考察超高效合相色譜對VC分離的影響因素，為準確檢測VC建立一種可靠、快速、節約型的分離分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮橘子、鮮棗、干棗、飲料（水溶C100） 市購。

VC（純度99%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司 ；CO2（純度99.997%） 蘭州匯能公司；甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純） 德國Merck KGaA公司；H3PO4（色譜純） 天津科密歐公司；蒸餾水 廣州屈臣氏。

1.2 儀器與試劑

超高效合相色譜儀（配有Waters EmpowerTM3數據處理系統） 美國Waters公司；冷凍離心機 美國Sigma公司；均質機 德國IKA公司；移液槍 美國Thermo Electron公司；50 mL聚乙烯管、容量瓶。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準貯備液：精確稱取0.020 g VC，用含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液，準確定容至100 mL容量瓶中，配制成200 mg/L的標準儲備液，4 ℃冷藏待用（4 h后重新配制）。

標準工作液：準確轉移1 000、750、500、250、100、50、25 μL標準貯備液分別稀釋為200、150、100、50、20、10、5 mg/L的標準工作液，4 ℃冷藏待用（4 h后重新配制）。

1.3.2 超高效合相色譜條件

色譜柱：Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為CO2，B為甲醇（含0.05% H3PO4溶液）；流速0.6 mL/min；進樣量1 μL；柱溫30 ℃；檢測波長245 nm；動態背壓2 000 psi；梯度洗脫：0～0.2 min時8%甲醇，3 min時甲醇8%～35%，4.3 min時甲醇35%～8%。

1.3.3 樣品處理

固體及半固體樣品：分別準確稱取樣品5.00 g于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，均質5 min，高速冷凍離心機于4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL（VC含量較高時可適當進行稀釋），經0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

液體樣品：準確稱取2.00 g飲料于50 mL聚乙烯管中，加入含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液至20 g，置于高速冷凍離心機于4 ℃以13 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，經0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

2 結果與分析

2.1 流速的選擇

超臨界CO2作為流動相時，由于具有的低黏度和高的擴散系數，使它在分離過程中具有較高的線速度，分析速度比傳統高效液相色譜快3～10 倍，分析時間更短，同樣，在此情況下，超臨界流體色譜可以使用更長的色譜柱，得到更大的柱效及分離效率。

本實驗通過使用超高效合相色譜，對亞2 μm填料的色譜柱進行流速優化，流速在0.4～1.0 mL/min范圍內進行優化，為了保證較好的靈敏度、色譜柱壓力以及盡可能與雜質的分離，本實驗選擇0.6mL/min為最佳流速。VC標準色譜圖見圖1。

圖1 VC標準色譜圖Fig.1 Chromatogram of vitamin C

2.2 助溶劑選擇

由于超高效合相色譜流動相主要是以CO2為主體的超臨界流體，為了調整流動相的極性以及對目標物的溶解性，可加入甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯等助溶劑，以適應對不同目標化合物的不同溶解性，有效改變目標化合物的峰形及保留時間。本實驗通過使用甲醇、異丙醇、乙腈3 種常用的、不同極性的助溶劑對VC進行分離，分別見圖2。

圖2 不同助溶劑分離的VC標準品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of vitamin C separated with different co-solvents

由圖2可以看出，隨著助溶劑極性的降低，流動相的溶解能力也相應得到改變，使得VC的出峰時間很大程度的推遲，甚至在使用乙腈為助溶劑時，VC因為保留太強而沒有出峰，因此，可以推斷出助溶劑的選擇對于目標化合物的峰形及保留時間起著至關重要的作用。

2.3 改性劑的選擇

由于VC為弱酸性、水溶性維生素，在酸性條件下可以適當改善維生素的峰形，故在流動相中加入少量的磷酸作為改性劑，實驗選擇0.05% H3PO4、0.1% H3PO4、0.15% H3PO4作為改性劑，結果發現3 種不同水平梯度的磷酸-甲醇溶液均對VC的拖尾峰形有較好的改善，VC標準色譜圖和未添加改性劑的色譜圖見圖1、圖2A。鑒于流動相酸性較高，長時間使用時會損傷色譜柱、降低柱效，故將0.05% H3PO4作為流動相的改性劑。

2.4 動態背壓的選擇

超高效合相色譜中，動態背壓是影響分離過程的重要因素之一。它主要作用是控制CO2在整個操作過程中維持超臨界狀態，當背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強，柱壓升高。本實驗以CO2和甲醇（含0.05% H3PO4）為流動相，考察背壓在1 800～2 200 psi范圍內對樣品分離的影響。結果表明，背壓越大，密度、黏度隨之增加，柱壓也會升高，使得目標物色譜峰的保留時間減少。通過對樣品基質、保留時間及色譜柱壓力的綜合考慮，當背壓為2 000 psi時，VC與雜質分離最好，時間最短、峰形對稱，故選擇背壓為2 000 psi。

2.5 色譜柱溫度選擇

為了對樣品中VC得到更好的分離效果，保持其他色譜條件不變，本實驗還考察柱溫在25～55 ℃范圍內對分離的影響。結果表明，隨著溫度的升高，VC的保留時間逐漸延長，這與傳統超高效液相色譜是不相同的。這是因為色譜柱溫度越高，超臨界流體密度越小，溶劑化能力降低，超臨界流體可能對VC溶解及交換能力減弱，使得VC的保留時間增大。另外，考慮到色譜柱溫度較高時，會加速VC的氧化分解，故本實驗選擇溫度30 ℃為最佳分離溫度。

2.6 方法考察

2.6.1 線性范圍和靈敏度

在優化實驗條件下，選取200、150、100、50、20、10、5mg/L的VC系列標準溶液按1.3.2節色譜條件進行測定，繪制樣品水平（橫坐標x，mg/L）與峰面積（縱坐標y，μU/s）標準曲線，進行線性回歸。結果表明，該方法在5～200 mg/L范圍內有較好的線性關系，線性方程為Y=3.13×103X-2.66×103，線性相關系數R2=0.998 9。該方法對VC的檢出限為1.5 mg/kg，定量限為5 mg/kg。

2.6.2 回收率和精密度

分別準確稱取5.00 g橘子和2.00 g飲料樣品，加入3 個水平的添加量（5、50 mg/kg和200 mg/kg）的VC，置于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，均質5 min，高速冷凍離心機于4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，經0.22 μm濾膜過濾后，按1.3.2節色譜條件進樣測定，計算其回收率。結果表明，該方法的加標回收率在96.05%～101.15%之間，相對標準偏差為0.52%～0.76%。方法的回收率和重復性均較好。

2.7 實際樣品測定

利用上述實驗優化條件，分別稱取橘子、飲料、鮮棗、干棗各5.00 g，置于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，經均質、離心后，取上清液1 mL過膜，按1.3.2節色譜條件進樣測定，見圖3，結果表明，橘子、飲料、鮮棗、干棗中VC含量分別為184.35、324.78、2 163.62、20.12 mg/kg。該測試方法可以對含VC的食品，無需進行復雜前處理，直接進樣、直接檢測。本方法完全能夠滿足VC的檢測。

圖3 樣品測定色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples

3 結 論

利用超高效合相色譜對VC進行檢測，整個前處理過程簡單、分析時間短、結果可靠，有效避免VC在長時間、復雜、繁瑣的前處理及檢測過程中的損失，很大程度的提高了食品中VC檢測的準確性。由于流動相為CO2超臨界流體，對環境幾乎不造成污染，運行成本低。本實驗通過超高效合相色譜法對VC檢測的研究可以看出，超高效合相色譜將對未來的色譜分析提供新的方向。

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Direct Determination of Vitamin C by Ultra Performance Convergence Chromatography

LIU Qian-qian1, ZHOU Wei1,2,3,*, WANG Bo2, WANG Li-ting3, YANG Sheng-xin3
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China; 3. College of Geography and Environment Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China)

A new method was developed for the determination of vitamin C in foods by ultra performance convergence chromatography (UPC2). The mobile phase was a mixture of supercritical CO2and methanol (containing 0.05% H3PO4) at a flow rate of 0.6 mL/min. A Waters CSH Fluoro-Phenyl column (3.0 mm × 100 mm, 1.7 μm) was used, and the UV detector was set at 245 nm. The limit of detection (LOD) was 1.5 mg/kg, and the calibration linear range was between 5 and 200 mg/L. The spiked recoveries of vitamin C were 96.05%-101.15%, with relative standard deviation (RSD) ranging from 0.52% to 0.76%. The method is efficient, rapid, simple, sensitive, accurate, repeatable and low-cost with a low limit of detection. It can be applied for the determination of vitamin C in foods.

ultra performance convergence chromatography (UPC2); vitamin C; determination; food

TS201.6

A

1002-6630（2014）16-0208-04

10.7506/spkx1002-6630-201416040

2013-10-31

劉倩倩（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：119252610@qq.com

*通信作者：周圍（1957—），男，研究員，博士，研究方向為食品營養及食品安全分析。E-mail：zhouwei845@163.com