QuEChERS-高效液相色譜-質譜法檢測食品中14 種真菌毒素

史 娜，侯彩云*，路 勇，姜 杰，張學亮

QuEChERS-高效液相色譜-質譜法檢測食品中14 種真菌毒素

史 娜1,2，侯彩云1,*，路 勇2，姜 杰2，張學亮3

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.北京市食品安全監控中心，北京 100041；3.北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京 100124）

建立QuEChERS-高效液相色譜-質譜檢測食品中14 種真菌毒素的方法。均質樣品用1%乙酸-乙腈提取，經分散固相萃取凈化后，采用ACQUITU UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分離。采用電噴霧電離、多反應監測方式，可同時對食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、青霉酸、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、桔青霉毒素、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、HT-2毒素、T-2毒素、鬼臼毒素14 種真菌毒素進行定性和定量分析。最低檢出限為0.5～1 μg/kg。該方法簡便快速、選擇性佳、靈敏度高，適用于食品安全事件分析中真菌毒素的分析。

真菌毒素；QuEChERS；高效液相色譜-質譜；篩選；食品

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產生的代謝產物，是有毒的二級代謝產物，目前已知的真菌毒素有200多種，按其主要產毒菌種可分為曲霉菌毒素（如黃曲霉毒素、棕曲霉毒素等）、青霉菌毒素和鐮刀菌毒素（如T-2毒素、HT-2毒素、二乙酰藨鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等）等幾大類。人或動物攝入被真菌毒素污染的食物可引發多種中毒癥狀，嚴重危害人類的身體健康。據調查，除飼料和糧食外，在花生、烘焙食品、水果和果汁、蔬菜等人們常食用的食物中都發現了有真菌污染的現象。因此，控制真菌毒素對于生產效益、動物福利、產品質量和食品安全都是至關重要的[1-4]。

對于食品中真菌毒素的檢測方法很多[1,5]，薄層層析法雖然簡便，但精確度低、操作過程復雜、分析結果的可重復性和再現性差；免疫化學檢測法通常具有高的選擇性和很低的檢出限，廣泛用于各種抗原、半抗或抗體的測定，一般可分為熒光免疫法、發光免疫法、免疫法及電化學免疫法等非放射免疫法和放射免疫法[6-10]；色譜法主要包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、液相色譜-質譜聯用等。真菌毒素大部分是熱不穩定的，因此氣相色譜法只應用于個別真菌毒素的檢測[11-13]；高效液相色譜法靈敏度高、穩定性好，但是對于同分異構體和同系物就無法進行多組分析；液相色譜-質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[14]的優點非常顯著，LC與高選擇性、高靈敏度的MS-MS結合，可對復雜樣品進行實時分析，即使在LC難分離的情況下，只要通過MS1及MS2對目標化合物進行中性碎片掃描，則可發現并突出混和物中的目標化合物，顯著提高信噪比，LC-MS-MS技術在食品中毒物分析中顯示出越來越廣闊的應用前景。目前國內對多種真菌毒素同時檢測多采用免疫親和柱、凝膠色譜等進行凈化處理[15-17]，對于采用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）進行凈化處理的文獻鮮有發表。

QuEChERS是由美國化學家Lehotay和德國的Anastassiadas于2003年提出的一種快速、簡便、便宜、有效、可靠及安全的樣品處理技術[18]，最早在農藥多殘留中使用[19-20]。本實驗采用先進的QuEChERS技術進行樣品處理，通過優化樣品前處理條件及色譜-質譜條件，建立了多反應離子模式分別測定14 種真菌毒素的新方法。本方法可為處理食品安全事件中真菌毒素的篩選提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀烯醇、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、桔青霉毒素、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、鬼臼毒素（均為規格1 mg、純度98%） 美國TRC公司；雜色曲霉毒素、HT-2毒素、T-2毒素、青霉酸（均為規格1 mg、純度99%） 美國Sigma公司，用甲醇溶液將標準樣品配制成100 μg/mL標準儲備液。甲醇、乙酸銨、甲酸 United States Dikma Dikmapure公司；實驗室用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》中二級水的規定。

1.2 儀器與設備

TQ-S超高效液相色譜-四極桿質譜聯用儀、DisQuE基質固相分散樣品制備試劑盒、DisQuE提取管（1 支50 mL體積的離心管，內裝4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉和二水結晶鹽以及0.5 g的檸檬酸氫二鈉合一個半水結晶鹽）、高速冷凍離心機 美國Waters公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters ACQUITy UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：0.1%甲酸（B）和乙腈（A），洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 HPLC Gradient elution conditions

1.3.2 質譜條件

表2 MRM所用的母/子離子Table 2 Precursor/daughter ions used in multiple-reaction monitoring (MRM) mode

電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，正離子掃描，多反應監測（multi-reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓2.5 kV；離子源溫度900 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣流速1 000 L/h，14 種化合物的質譜分析參數見表2，總離子流圖見圖1，MRM色譜圖見圖2。

圖1 14 種藥物的TIC色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of 14 mycotoxins

圖2 14 種藥物的多反應監測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 14 mycotoxins

1.3.3 樣品前處理方法

粉碎樣品后精密稱取4.000 g于50 mL DisQuE提取管中，加入16 mL 1%的乙酸-乙腈。渦旋振蕩5 min至充分混勻，超聲5 min，10 000 r/min離心10 min。吸取8.0 mL上述乙腈提取液至15 mL DisQuE清除管中，渦旋振蕩30 s，10 000 r/min離心5 min。吸取4.0 mL上述提取液至旋蒸瓶中，旋蒸至近干，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5∶95）定容至1 mL，渦旋使其充分溶解，過有機膜后待進樣分析。

1.3.4 標準工作曲線的制備

將14 種標準樣品分別用甲醇配制成100 μg/mL的標準儲備液，保存期限為半年。做實驗時現配1 μg/mL混合標準液（分別吸取14 種標準儲備液10 μL，用甲醇定容至10 mL），然后在逐級稀釋成需要的質量濃度。采用高效液相色譜-質譜進行測定，以質量濃度X為橫坐標、峰面積Y為縱坐標，繪制標準工作曲線。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優化

由于不同樣品基質性質相差較遠，如果要快速同時篩查出多種真菌毒素，就要將提取效率提高的同時還要把不同樣品中目標化合物損失降到最小。因此，食品中有毒化合物的前處理方法的關鍵是選擇提取效率好的提取溶劑和凈化好的凈化方法，減少目標化合物在不同樣品前處理過程中的損失。

2.1.1 提取溶劑的選擇

考察不同提取劑在豆制品、面制品、牛奶樣品中的真菌毒素的的提取效果，發現甲醇、無水乙醇、丙酮對部分化合物的回收率影響很大。用1%乙酸-乙腈提取所有目標物的回收率基本可以滿足分析要求，回收率為65.3%～130.1%，且干擾較少，因此選擇乙腈作為提取劑。

2.1.2 凈化條件的優化

實驗過程中發現直接用提取劑提取時，基質效應比較強，導致色譜峰不好，而且同時對色譜柱和儀器的損壞較大。基質固相分散是一種新的提取凈化技術，可以將樣品的分散、萃取及凈化一次完成，省時省力，操作方便，對色譜柱和儀器起到了很好的保護作用。因此選為本研究的樣品處理方法。

同時對DisQuE基質分散樣品制備試劑盒里兩種不同的提取管A和B做了比較。其中，DisQuE基質固相分散樣品制備試劑盒（DisQuE提取管A：1支50 mL離心管，內裝1.5 g無水乙酸鈉和6 g無水硫酸鎂。DisQuE凈化管：15 mL管內有 900 mg無水硫酸鎂和150 mg PSA的硅膠基伯胺仲胺鍵合相吸附劑；DisQuE提取管B：1支50 mL離心管，內裝4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉和二水結晶鹽、以及0.5 g的檸檬酸氫二鈉合一個半水結晶鹽）。比較結果見表3，發現使用DisQuE提取管B的多數回收率稍高，因此選用DisQuE提取管B提取目標物。

表3 DisQuE提取管的毒素種類比較Table 3 Comparison of different extraction tubes

2.1.3 樣品濃縮方式的選擇

實驗過程中在對樣品的有機氮吹和旋轉蒸發兩種常見的濃縮方式進行了探究，結果發現氮吹導致樣品損失比較大，耗時比較長，耗費氮氣比較多，且提取液直接到大氣中對身體和環境的負面影響較大，因此實驗選擇了旋轉蒸發的方式進行濃縮。

2.1.4 樣品過濾器的選擇

樣品經溶劑提取濃縮后，可能存在一些殘渣或雜質，容易導致液相色譜柱堵塞，同時也會污染串聯四極桿質譜，影響篩查結果也會損傷儀器，因此需要使用過濾器對樣品進行凈化。實驗室常用的過濾器主要有聚醚砜、尼龍和聚四氟乙烯。聚醚砜過濾器主要是用于過濾水系樣品，實驗考察了尼龍和聚四氟乙烯過濾器對目標化合物的吸附作用。實驗考察發現，聚四氟乙烯過濾器對藥物的吸附作用不大，因此采用聚四氟乙烯過濾器對樣品進行凈化。

2.2 色譜與質譜條件的優化

2.2.1 流動相的選擇

實驗對流動相的選擇考察水-甲醇、乙酸胺-甲醇、水-乙腈、乙酸胺-乙腈、甲酸溶液-乙腈由于14 種毒素采用電噴霧正電離模式采集，結果表明0.1%的甲酸溶液-乙腈的整體分離效果比較好，因此，選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相，進行梯度洗脫，在7 min內對14 種毒素進行分離。

2.2.2 質譜條件的選擇

對研究的14 種毒素的化學結構進行研究和相關文獻資料表明電噴霧正離子模式掃描就可以滿足實驗研究的需求。因此，選擇電噴霧正離子模式掃描。

2.3 方法的驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

根據14 種化合物的響應強弱，配制不同質量濃度的混合標準溶液標準曲線。以峰面積對樣品的濃度進行線性回歸，結果表明在0.5～20 μg/L質量濃度范圍內具有良好的線行關系（表4）。在定量下限附近添加一系列低質量濃度的樣品，以信噪比大于等于3（RSN≥3）的最低質量濃度為最低檢出限，實驗得出檢出限為0.5～1 μg/kg。

表4 14 種化合物標準溶液通過LC-MS-MS分析所得曲線Table 4 LC-MS-MS analytic curves of 14 standard solutions

2.3.2 方法回收率和精密度

表5 14 種化合物的回收率和相對標準偏差Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of 14 compounds

分別取豆制品、面粉、牛奶制品空白食品樣品（均為實驗室已有陰性樣本），添加低、中、高3個水平的14 種化合物混合標準溶液，進行前處理，測定目標化合物。每個水平進行6 次實驗，結果見表5，14 種化合物的平均回收率為65.3%～130.1%，相對標準偏差為0.56%～11.40%。

3 結 論

本研究通過對樣品前處理方法、提取劑和LC-MSMS條件優化，建立了一套可以同時檢測豆制品（如豆腐干）、面粉（如玉米面）、牛奶制品（如奶粉）中真菌毒素的篩查方法。本方法利用基質固相分散樣品制備試劑盒，采用乙腈提取，得到了較好的提取效果。同時利用定性定量離子對進行確證，通過MRM進行信號采集，空白樣品加標回收實驗得到了較高且穩定的回收率。該方法快速、簡便、靈敏、準確，適用樣品基質范圍廣，尤其適合食品安全突發事件的快速應急處置工作。

對于本實驗研究的方法，已經多次成功應用于北京市食品安全突發事件處理中，并且取了很好的效果，在食品安全監管工作中的技術支撐作用，切實為首都食品安全保駕護航。

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Simultaneous Screening for 14 Mycotoxin Contaminants in Foods by QuEChERS-LC-MS-MS

SHI Na1,2, HOU Cai-yun1,*, LU Yong2, JIANG Jie2, ZHANG Xue-liang3
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China; 3. College of Life Science and Bioen gineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

This paper presents a QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass chromatography (LC-MS-MS) method for the simultaneous screening for 14 mycotoxin contaminants (deoxynivalenol, penicillic acid, afl atoxin M1, afl atoxin G2, citrinin, aflatoxin B1, aflatoxin B2, aflatoxin G1, zearalenone, ochratoxin A, sterigmatocystin, HT-2 toxin, T-2 toxin and podoph yllotoxin) in foods. The homogenized samples were extracted with 1% acetic acid in acetonitrile. The separation was performed on an ACQUITU UPLC BEH C18column (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) by gradient elution after purifi cation by dispersive-solid-phase extraction (d-SPE). The 14 mycotoxin contaminants in foods analyzed by LC-MS-MS-ESI in the positive ionization, multiple-reaction monitoring (MRM) mode. The minimum detection limit was 0.5-1 μg/kg. The developed method proved to be simple, rapid, highly selective and sensitive, and suitable for the analysis of mycotoxin contaminants in food safety incidents.

mycotoxin contaminants; QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); screening; food

TS207.3

A

1002-6630（2014）16-0190-07

10.7506/spkx1002-6630-201416037

2013-06-20

史娜（1982—），女，工程師，學士，研究方向為食品安全檢測分析。E-mail：bjshina@hotmail.com

*通信作者：侯彩云（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品安全檢測技術。E-mail：13910065708@139.com