UPLC-MS-MS法測定飼料、原料乳及乳制品中3 種氯霉素類藥物殘留

胡 雪，李翠枝*，劉麗君，康 愷，白艷梅，段國霞，張立佳

UPLC-MS-MS法測定飼料、原料乳及乳制品中3 種氯霉素類藥物殘留

胡 雪，李翠枝*，劉麗君，康 愷，白艷梅，段國霞，張立佳

（內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

建立超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法檢測飼料、牛乳及廣義乳制品中氯霉素類藥物殘留的通用檢測方法。研究適用于檢測飼料、原料乳、液體乳、發(fā)酵乳、含乳飲料、乳粉、奶片、冷凍飲品中氯霉素類藥物的前處理方法以及適用的超高效液相色譜及質譜條件。樣品經(jīng)低溫冷凍沉淀蛋白質后，乙腈提取，飽和氯化鈉使乙腈、水分層，取上清液氮氣吹干定容后，正己烷除脂，乙腈、水梯度洗脫，電噴霧負離子多反應監(jiān)測模式進行檢測。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素定量限0.1 μg/kg。氯霉素類藥物添加范圍0.1～2.5 μg/kg時，基質效應為57.9%～139.2%，回收率為64.3%～120.2%，相對標準偏差為2.1%～10.0%。該方法具有簡單方便、檢測周期短、適用于更廣泛樣品檢測的特點。

超高效液相色譜-質譜聯(lián)用；氯霉素類藥物；飼料；乳制品

農業(yè)部235號公告中規(guī)定，乳中不得檢出氯霉素，甲砜霉素殘留限量為50 μg/kg，GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》中規(guī)定動物源性食品中氯霉素的定量限0.1 μg/kg。對于大型的乳品企業(yè)或者檢測機構來說，經(jīng)常要同時監(jiān)測原料乳及各種乳制品中的氯霉素類藥物殘留，有時還要溯源到奶牛食用的飼料。但是在檢測的時候飼料和乳制品需要用不同的檢測方法[1-2]，而且國標和參考文獻中涉及到的樣品都有一定的適用范圍[3-9]，步驟較為繁瑣[10-15]，檢驗成本較高[16]，不適用于大量、快速地對飼料、原料乳及乳制品中氯霉素類藥物殘留進行排查。廣義的乳制品除了常規(guī)認為的液體乳、乳粉，還包括發(fā)酵乳、奶片、含乳飲料及含乳冷凍飲品等。雖然有針對含乳冷凍飲品的檢測方法[17]，但其乙酸乙酯的提取方法只適用于純乳雪糕及老冰棍，大部分成分復雜的冷凍飲品在液-液萃取的時候會出現(xiàn)嚴重的乳化現(xiàn)象。本工作擬利用一種簡單并適用于更多樣品的前處理方法結合超高效液相色譜-質譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法實現(xiàn)對乳品行業(yè)所涉及到的飼料及產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留的快速、高效、準確排查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼料包括青貯飼料和豆粕飼料；液體乳包括純牛乳和核桃乳；發(fā)酵乳包括原味發(fā)酵乳和大果粒發(fā)酵乳；乳粉包括嬰幼兒配方乳粉和成人乳粉；冷凍飲品包括含巧克力的和含豆類的。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素（純度均大于97%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；同位素標準品氯霉素-D5美國Cambridge Isotope Laboratories公司；乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純） 德國Meker公司。

1.2 儀器與設備

SIGMA 3K30低溫高速離心機（溫度可設置0 ℃，轉速可設置20 000 r/min） 德國Sigma公司；TQ Detector超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

牛乳、液體乳、發(fā)酵乳、含乳飲料等液體樣品稱取5 g試樣，置于30 mL具塞離心管中，加入2 g氯化鈉、10 mL乙腈和100 μg/mL的內標溶液50 μL，渦旋混勻。在4 ℃冰箱中靜置20 min，之后0 ℃、10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液于35 ℃氮氣流下吹干，用0.5 mL 20%甲醇溶液溶解，旋渦振蕩，加入0.5 mL正己烷，旋渦振蕩，轉移至1.5 mL離心管中，4 ℃、20 000 r/min離心5 min，吸取下層液體至進樣瓶中，供超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析使用。飼料、乳粉、奶片、冷凍飲品等固體樣品均質粉碎后取0.5 g試樣，置于30 mL具塞離心管中，加入5 mL、40 ℃超純水，混勻后前處理步驟與液體樣品相同。成分復雜的冷凍飲品用正己烷除脂兩次，可以得到清澈的待測液。

1.3.2 標準曲線的制備

分別準確稱取適量的氯霉素、氯霉素-D5、甲砜霉素和氟甲砜霉素標準物質，用乙腈配制成100 μg/mL標準儲備溶液，4 ℃避光保存，標準儲備液在6 個月內穩(wěn)定。將氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素用20%甲醇溶液配制成100 μg/L的混標，氯霉素-D5單獨稀釋成100 μg/L的中間工作液。將100 μg/L的混標用20%甲醇溶液配制為適當質量濃度（0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 μg/L）的標準工作液，標準工作液含內標質量濃度為2.5 μg/L。氯霉素用內標法定量，甲砜霉素、氟甲砜霉素用外標法定量。

1.3.3 空白基質標線的制備及添加回收率

樣品相同的前處理方法得到空白基質液，用該空白基質液將混標配制成所需質量濃度的標準工作液，上機后得到空白基質標線。添加回收率實驗，在陰性樣品中添加一定質量濃度的混標，混勻后按照樣品前處理方法進行處理，上機后得到的結果與理論添加值的比值，即為回收率。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為乙腈，B為水；流速：300 μL/min；線性梯度洗脫條件：0～2 min，5%～45% A；2～3 min，45%～55% A；3.0～3.5 min，55%～100% A；3.5～4.0 min，100%～5% A；4～5 min，5% A。

1.3.5 質譜條件

電離模式：電噴霧負離子模式；毛細管電壓：2.8 kV；源溫：120 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；碰撞室壓力：0.31 Pa（3.1×10-3mbar）。多反應監(jiān)測方式檢測，其他質譜條件見表1。

2 結果與分析

2.1 前處理方法選擇

乙腈和乙酸乙酯是氯霉素類藥物常用的提取液，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)大多數(shù)成分復雜的嬰幼兒乳粉及冷凍飲品用乙酸乙酯提取時會發(fā)生嚴重的乳化現(xiàn)象，因此選擇乙腈作為提取液。但是乙酸乙酯可以和水分層，乙腈和水互溶，因此添加氯化鈉，使得飽和氯化鈉溶液和乙腈分層明顯。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，常溫離心和冷凍離心的區(qū)別非常明顯，樣品經(jīng)過充分降溫并在0 ℃高速離心后，脂肪蛋白沉淀增多，上清液更加透明，因此選擇冷凍離心。除了成分復雜的冷凍飲品以外，其他的樣品經(jīng)過正己烷一次除脂以后可達到上機要求，部分冷凍飲品經(jīng)過正己烷一次除脂以后依然混濁，此時棄去上層正己烷，進行二次除脂可達到上機要求。

2.2 液相條件選擇

色譜柱選擇Acquity UPLC BEH C18柱，氯霉素類藥物在C18柱上的保留性不是很強，為了推后出峰時間，實現(xiàn)更好地分離效果，減少基質效應，選用梯度洗脫，起始流動相中有機相含量選擇C18柱的最低耐受量5%。流動相體系選擇6 種進行比較，分別為0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-甲醇、10 mmol/L乙酸銨-乙腈、水-甲醇、水-乙腈，純牛乳空白基質配制標準工作液質量濃度為2.5 μg/L，不同液相條件下的總離子流色譜圖如圖1所示。甲醇體系雖然分離效果更好，但是都有嚴重的拖尾現(xiàn)象，乙腈體系峰形優(yōu)于甲醇體系，而且甲砜霉素在乙腈體系中響應值更高。在3 種乙腈體系中，水-乙腈的響應值最高。因此，綜合考慮基質效應、分離效果、峰形和響應值高低，最終選擇水-乙腈體系。

圖1 不同液相條件下的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms obtained with different mobile phases

2.3 基質效應實驗

質譜基質效應的影響因素有很多，可以優(yōu)化的條件包括樣品前處理、同位素內標、色譜分離、質譜分析等[18-19]。本實驗采用的前處理方法和液相方法較簡便，同時檢測的樣品種類繁多，因此氯霉素采用內標法定量。針對不同類樣品，選擇具有代表性的樣品進行了基質效應的考察。用每種空白基質配制2.5 μg/L的標準工作液與用20%甲醇配制的標準工作液進行比較，二者峰面積做比值，大于100%的有基質增強作用，小于100%的有基質抑制作用[20]。每個樣品重復條件下做5 次，取平均值，不同類樣品基質效應的結果見表2。飼料有明顯的基質抑制作用，其他樣品都有不同程度的基質增強作用，基質增強較明顯的是發(fā)酵乳，因此在定量的時候，飼料和發(fā)酵乳要用空白基質配制標準曲線。

表2 各種樣品的基質效應Table 2 Matrix effects of different samples %

2.4 準確度與精密度實驗

每類樣品選擇具有代表性的樣品進行回收率實驗，6 次結果計算平均值，對于基質效應較強的樣品如飼料和發(fā)酵乳，用空白基質配制標準曲線進行定量，測定數(shù)據(jù)見表3。

表3 不同樣品回收率及相對標準偏差實驗結果Table 3 Recovery and relative standard deviation (RSD) of different samples

由表3可知，按已確定的樣品前處理條件和儀器條件測定添加回收率，其回收率達到64.3%～120.2%，相對標準偏差在2.1%～10.0%，說明該方法適用于飼料、原料乳和廣義乳制品中不同含量氯霉素類藥物殘留的測定，均有較好的準確度和精密度。選擇國標規(guī)定的定量限0.1 μg/kg做回收率添加實驗，其中，基質抑制最明顯，響應值最低的青貯飼料，氯霉素信噪比為29.6，甲砜霉素信噪比為17.0，氟甲砜霉素信噪比為26.9，所有樣品在該添加水平測得的信噪比均大于定量限信噪比10。因此該方法定量限依據(jù)國標定為0.1 μg/kg。

3 結 論

提供了一種適用于飼料、原料乳及更廣泛樣品快速簡單的UPLC-MS-MS檢測方法，對前處理、液相條件進行了優(yōu)化，在氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的添加量為0.1～2.5 μg/kg時，其準確度和精密度均符合要求，定量限和國標中規(guī)定的一致。考察了飼料、原料乳及廣義乳制品用冷凍法沉淀蛋白，乙腈提取，正己烷除脂的前處理條件下，不同樣品的基質效應，保證了該檢測方法的可靠性。與其他檢測方法相比，該檢測方法具有以下特點：前處理簡單，節(jié)省檢測成本，檢測周期短，適用于乳品行業(yè)從源頭（飼料）一直到產(chǎn)品（更廣泛樣品）所涉及到的樣品的檢測。

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Determination of Chloramphenicol, Thiamphenicol and Florfenicol Residues in Feed, Raw Milk and Dairy Products by UPLC-MS-MS

HU Xue, LI Cui-zhi*, LIU Li-jun, KANG Kai, BAI Yan-mei, DUAN Guo-xia, ZHANG Li-jia
(Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010110, China)

An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) method for simultaneous determination of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol residues in feed, raw milk and dairy products was developed. The extraction procedures and the UPLC-MS-MS conditions for feed, raw milk, liquid milk, fermented milk, milk drinks, milk powder, milk tablet and frozen drinks were studied. After protein in samples was precipitated by cooling down, the compounds were extracted into acetonitrile, which was separated into layers in the presence of added saturated sodium chloride. The supernatant was dried under nitrogen, and then re-dissolved before the removal of fat by addition of n-hexane. The compounds were analyzed in a negative electrospray ion multiple reaction monitoring mode with a mobile phase composed of acetonitrile and water by means of gradient elution. The limit of quantification (LOQ) was 0.1 μg/kg for chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol. The matrix effects, recovery rates, and relative standard deviation (RSD) were 57.9%-139.2%, 64.3%-120.2% and 2.1%-10.0%, at fortification levels of 0.1-2.5 μg/kg for chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol, respectively. This method is simple, convenient, fast and suitable for the quantification and confirmation of chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol in feed, milk and dairy products.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); chloramphenicol; feed; dairy products

TS252.7

A

1002-6630（2014）16-0110-04

10.7506/spkx1002-6630-201416021

2013-10-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B00）

胡雪（1981—），女，工程師，碩士，研究方向為檢測分析。E-mail：jthuxue@yili.com

*通信作者：李翠枝（1969—），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全預防控制。E-mail：lczg@yili.com