響應面法優化海蓬子皂苷提取工藝條件與生物活性研究

梁 彬，李 娟，余 杰*，陳美珍

（汕頭大學理學院生物 學系，廣東 汕頭 515063）

響應面法優化海蓬子皂苷提取工藝條件與生物活性研究

梁 彬，李 娟，余 杰*，陳美珍

（汕頭大學理學院生物 學系，廣東 汕頭 515063）

響應面分析法優化海蓬子皂苷提取工藝，初步鑒定海蓬子皂苷的 結構，并探討其對α-葡萄糖苷酶與胰脂肪酶的體外抑制活性。海蓬子皂苷最佳提取條件為料液比1∶27（g/mL）、乙醇體積分數62%、超聲時間30 min。在此條件下，海蓬子皂苷的提取量為10.14 mg/g；顯色反應和紅外光譜初步分析表明，海蓬子皂苷為四環三萜類皂苷；體外實驗表明，經純化的海蓬子皂苷提取物對α-葡 萄糖苷酶和胰脂肪酶均有較強抑制作用，并呈劑量效應，對α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的抑制率分別達到68.20%和84.28%。該結果提示海蓬子皂苷可能具有阿卡波糖樣的降血糖機制以及降血脂的功效。

海蓬子；皂苷；響應面分析法；α-糖苷酶；胰脂肪酶

皂苷是一類以三萜或甾體為苷元，具有較高分子質量的糖苷類化合物，它廣分布于植物中，是一類具有多種生理功能、高藥理活性的天然化合物[1]。研究證實，皂苷具有降血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、免疫調節、抗菌抗病毒等作用[2-4]，可應用于醫藥和功能食品等。因此，對皂苷的研究已成為國內外的熱門領域。

海蓬子為藜科鹽角草屬的無葉莖肉質化真鹽生植物，亦稱為海蘆筍，原產美洲鹽沼地[5]，在中國東南沿海地區也已引種成功并規模化栽培[6]。素有“海人參”和“植物海鮮”之美譽，是一種利用海水灌溉種植的保健、無公害的綠色時令蔬菜[7]，其色澤如翡翠、口感脆嫩，具有獨特鮮美的海鮮風味，成為消費者的新寵。海蓬子富含膳食纖維、維生素等營養成分和黃酮類、甾醇、皂苷等生理活性物質[8]，藥用和保健價值高，具有抗癌、降血糖、減肥和防治便秘等功效[9-11]。日、美等一些國家將海蓬子作為高檔保健蔬菜食用，相繼開發了降血脂減肥茶和生物鹽等產品。

海蓬子嫩尖組織中含微量皂苷，能顯著降低血管壁上的膽固醇。有研究發現，海蓬子的50%乙醇提取物能使營養性肥胖ICR小鼠減肥，并具有降血脂和降血糖作用[12-13]。但目前國內外對海蓬子生理活性的研究才剛剛起步，有關其皂苷活性成分研究鮮見報道。為此，本研究采用響應面分析法對海蓬子皂苷的提取工藝條件進行優化，對其皂苷結構作了初步鑒定，并通過在體外建立酶反應體系，考察該成分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制效果，以評價海蓬子皂苷的降血糖和調血脂活性，從而探討海蓬子開發成高血糖人群或肥胖癥人群日常保健食品的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蓬子嫩莖由汕頭市南澳試驗站提供，洗凈后于60 ℃烘干，粉碎過40目篩。再用石油醚浸泡除色素，得海蓬子固體粉末，密封保存，備用。

齊墩果酸標準品 中國食品藥品檢定研究院；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG） 德國西德伊默克公司；豬胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶 美國Sigma公司；阿卡波糖 拜耳醫藥保健有限公司；NaH2PO4?2H2O、Na2HPO4?12H2O、乙醇等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NJL07-5超聲波細胞粉碎機 南京杰全微波設備有限公司；Universal 320R臺式冷凍離心機 德國Hettich公司；低溫冷凍干燥機 上海比朗儀器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；DBS-100電腦全自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；2100型UV-2100分光光度計 龍尼柯（上海）儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海蓬子皂苷的提取工藝

海蓬子干粉→60%乙醇水溶液超聲提取→提取液離心→減壓濃縮→乙醚萃取分離脫脂→上清液濃縮至干→甲醇溶解定容至25 mL→稀釋后顯色測定含量

1.3.2 皂苷含量的測定

采用香草醛比色法。以齊墩果酸為標準物，試劑的配制和標準曲線繪制等參照文獻[14]進行。經測定得到標準曲線方程為y=0.005 5x－0.095 2，相關系數R2=0.999 9。

1.3.3 海蓬子皂苷提取單因素試驗

分別以不同的乙醇體積分數、料液比、提取時間為單因素進行試驗，考察各因素對海蓬子皂苷提取量的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，選取料液比、提取溫度、提取時間作為Box-Behnken設計的自變量，海蓬子提取量為響應值進行響應面優化組合，因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平編碼表Table1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

1.3.5 海蓬子皂苷的純化

在以乙醇為溶劑提取皂苷過程中，海蓬子中一些極性與之相近的物質也隨之被提取出來，導致皂苷提取物純度低、色澤差[15]。因此，采用大孔吸附樹脂對皂苷粗提物進行純化，純化后的皂苷提取物作為生物活性試驗的試樣。

大孔樹脂洗脫的洗脫條件為依次用蒸餾水、0.2%堿液和水洗至中性，然后再用30%乙醇及60%乙醇進行洗脫，收集60%乙醇洗脫液，濃縮后冷凍干燥得到樣品。

經大孔吸附樹脂純化后，海蓬子皂苷提取物純度由7.403%提高至52.8%，得率為44.7%。

1.3.6 皂苷結構的初步鑒定

將通過大孔吸附樹脂處理后的皂苷提取物，用乙酸乙酯-甲醇溶劑梯度洗脫純化后進行結構鑒定。

1.3.6.1 皂苷顯色反應

氯仿-濃硫酸反應：樣品溶于氯仿中，加入濃硫酸后，氯仿層呈紅色或藍色，硫酸層則呈綠色熒光。

Liebermann-Burchard反應：將試樣溶于氯仿中，加入濃硫酸-乙酐（1∶20，V/V）數滴，觀察顏色變化。甾體皂苷呈藍綠色，三萜皂苷呈紅或紫色，可利用此反應區分甾體皂苷與三萜皂苷[16]。

1.3.6.2 紅外光譜分析

取少許海蓬子皂苷純化樣品，用KBr壓片，同時做空白對照，用紅外光譜儀在4 000～500 cm－1波數范圍掃描并記錄圖譜。

1.3.7 海蓬子皂苷體外抑制α-糖苷酶活性實驗

1.3.7.1 α-葡萄糖苷酶活力測定

參照王斯慧等的方法[17]進行。將α-葡萄糖苷酶（0.5U/mL，0.6 mL）在37 ℃水浴中孵育10 min，加入底物PNPG（20 mmol/L，1 mL）以啟動反應。體系于37 ℃反應20 min后，加入1 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應，然后于405 nm波長處測定在酶的作用下從PNPG中釋放出的對硝基酚的量。酶活力單位定義為：在37 ℃、pH 6.8條件下，1 min內水解PNPG釋放1 μmol對硝基酚所需的酶量。

1.3.7.2 皂苷提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的測定

參照上述方法，在反應體系中加入不同濃度的 抑制劑溶液1 mL，陽性對照為阿卡波糖，空白對照為不加抑制劑（以蒸餾水補足），其他與抑制劑管操作相同背景，對照為對應濃度的抑制劑溶液，不加酶液（以蒸餾水補足）。其他與抑制劑管操作相同，其反應體系如表2所示，反應終止后用蒸餾水稀釋定容至10 mL，于405 nm波長處測其吸光度，并計算抑制率。酶抑制實驗重復3次，每次3個復管。

表 22 α-葡萄糖苷酶的抑制體系Table2 Inhibitory system ofα -glucosiiddaasseemL

式中：I2為抑制率/%；A1、A2、A3、A4分別為波長405 nm處，空白管、空白對照管、抑制劑管和背景對照管的吸光度。

1.3.8 海蓬子皂苷體外抑制胰脂肪酶活性實驗

1.3.8.1 胰脂肪酶活性測定

按照霍世欣等[18]方法進行測定。其中，脂肪酶活力單位定義為在pH 7.5、溫度40 ℃條件下，每分鐘催化脂肪水解生成1 μmol脂肪酸的酶量，定義為一個酶活力單位。

1.3.8.2 對胰脂肪酶抑制作用的測定

按上述脂肪酶酶活測定方法操作，并加入定量脂肪酶抑制劑（皂苷提取物）后，測定其剩余酶活，重復實驗3次，按以下公式即可計算出胰脂肪酶抑制率。

抑制劑對α-葡萄糖苷酶的抑制率計算：

式中：X為胰脂肪酶活力/（U/mL）；c為脂肪酸濃度/（μmol/mL）；v為脂肪酸溶液體積/mL；v’為酶液用量/mL；t為作用時間/min；I1為抑制率/%；X1為抑制后的胰脂肪酶活力/（U/mL）。

2 結果與分析

2.1 海蓬子皂苷提取的單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對皂苷提取量的影響

準確稱取海蓬子干粉5 g，在超聲時間30 min、料液比1∶20條件下，加入不同體積分數的乙醇溶液提取皂苷，結果見圖1。當乙醇體積分數60%時，皂苷提取量達到最大值，繼續增大乙醇的體積分數，皂苷提取量反而下降。

圖1 乙醇體積分數對皂苷提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of saponin

2.1.2 超聲時間對皂苷提取量的影響

圖2 超聲時間對皂苷提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonification time on extraction efficiency of saponin

在料液比1∶20、乙醇體積分數60%條件下，考察不同提取時間對皂苷提取量的影響，結果如圖2所示。可知皂苷提取量隨提取時間的延長而提高，提取30 min后達到最大值，而繼續延長提取時間，皂苷提取量反而下降，這可能因提取時間長，部分皂苷被氧化所致。而在超聲時間超過40 min后，皂苷提取量又有略微上升，這有可能由于提取時間過長使某些雜質（如色素等）溶出增多，在測定皂苷含量時造成干擾所致。考慮到超聲時間過長有可能破壞其中皂苷的結構并使雜質過多 溶出，因此，提取時間不宜過長。

2.1.3 料液比對皂苷提取量的影響

圖3 料液比對皂苷提取量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction efficiency of saponin

在乙醇體積分數60%，超聲時間30 min的條件下，考察不同料液比對皂苷提取量的影響，結果見圖3。可看出皂苷提取量隨提取液使用量的增加而增大，當料液比達1∶30時，提取量達到峰值；料液比1∶35時，皂苷提取量下降，與料液比1∶25時相近。由于溶劑用量過大，會造成后續處理困難和成本提高，雜質的溶出也會增多，因此，綜合考慮經濟因素和后續工藝的簡化，液料比不大于30∶1為宜。

2.2 海蓬子皂苷最優提取工藝條件的確定

應用Box-Behnken試驗設計，以料液比、乙醇體積分數、超聲時間作為響應面設計的因素，皂苷提取量為響應值，采用三因素三水平的響應面分析方法優化海蓬子皂苷的提取工藝條件，結果見表3～5。

表3 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table3 The Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表4 方差分析Table4 Analysis of variance for the fitted regression equation

表5 回歸方程系數檢驗Table5 Regression coefficients and theirsignificance in the quadratic model

對所得數據采用SAS（statistics analysis system）進行回歸分析。從表4的回歸方程方差分析結果可知，用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（R2=97.79%），模型的顯著水平P＜0.01，此時二次回歸方差模型是極顯著的，方程對試驗擬合較好，說明試驗方法是可靠的。各因素經回歸擬合后得回歸方程：Y=10.086 7＋0.583 1A＋0.125 4B＋0.201 0C－1.539 7A2－0.274 3B2－0.984 4C2＋0.007 7AB－0.223 1AC－0.119 0BC。

由回歸方程系數顯著性檢驗（表5）可知，因素A對皂苷提取量線性效應極顯著，因素A2、AC顯著，說明實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。另外，回歸方程中二次項的系數為負值，表明回歸方程所對應的拋物線開口向下，存在最大值。同時，根據實驗數據繪出Y值隨A、B、C變化的關系圖，如圖4所示。在實驗區域內有最高點，即實驗結果Y在實驗區域內有最大值。由回歸模型的響應面圖可以看出，皂苷提取量隨著各兩因素的增加先呈上升趨勢，當各兩因素達到某一水平時，皂苷提取量增加緩慢，隨后下降。

綜合以上實驗結果，依據響應面試驗分析得到海蓬子皂苷的最佳提取工藝條件為料液比1∶27、乙醇體積分數62%、超聲時間30 min。在此工藝條件下進行驗證實驗，所得海蓬子皂苷的提取量為10.14 mg/g原料，與模型所得理論值10.160 9 mg/g原料相近，偏差較小。表明回歸方程能較真實地反映各因素對海蓬子皂苷提取量的影響，Box-Behnken設計所得到的模型擬合程度高，準確有效，用于優化篩選海蓬子皂苷提取工藝可行。

圖4 各因素交互作用對提取效果影響的等高線圖及響應面Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of extraction parameters on extraction efficiency of saponin

2.3 皂苷的鑒定

2.3.1 顯色反應

樣品在氯仿-濃硫酸顯色反應中，氯仿層呈紅色，硫酸層出現綠色熒光色，符合皂苷化合物的顏色反應。樣品的乙酸酐-濃硫酸反應呈紅色，表明該樣品皂苷可能為三萜類皂苷。

2.3.2 紅外光譜分析

圖5 海蓬子皂苷紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of saponin from Salicornia herbacea

從圖5可看出，2 024 cm－1處為C≡C鍵的伸縮振動；1 650 cm－1處為苯環的C=C鍵伸縮振動；1 382、1 267 cm－1分別為C—O鍵振動吸收峰和O—H鍵面內彎曲振動的吸收，為羧基（—COOH）的特征峰，表明化合物中含有羧酸；1 084 cm－1處為C—OH鍵的伸縮振動峰；988 cm－1處為β-D-吡喃糖苷的特征峰[19]，可以推斷其含有糖類化合物；853 cm－1和798 cm－1處為C—H鍵面外彎曲振動，為芳香化合物重要特征峰[20]。此外，在1 355～1 392 cm－1和1 245～1 330 cm－1處各有一個吸收峰，由此可推測海蓬子皂苷為四環三萜類皂苷[21]。

2.4 皂苷提取物體外對α-糖苷酶活的抑制作用

圖6 皂苷對α-糖苷酶的抑制曲線Fig.6 Inhibitory effect of saponin from Salicornia herbacea on α-glycosidase

由圖6可以看出，海蓬子皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶具有明顯抑制作用，其抑制率隨質量濃度的上升而增大，呈劑量效應。在其在質量濃度為2 mg/mL時，抑制率達到68.20%。而陽性對照阿卡波糖為α-葡萄糖苷酶的抑制劑，是臨床上常用的治療糖尿病藥物，其質量濃度僅為1.50 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率即高達92.30%。本實驗結果提示，海蓬子皂苷可能具有阿卡波糖樣的降血糖機制，值得進一步深入研究。

2.5 皂苷提取物對胰脂肪酶的抑制活性

由圖7可見，海蓬子皂苷提取物對胰脂肪酶最大抑制率為84.28%，半抑制濃度（half maximal（50%）inhibitory concentration，IC50）為1.01 mg/mL。

圖7 皂苷對胰脂肪酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of saponin from Salicornia herbacea on pancreatic lipase

3 討論與結論

3.1 響應面分析法由一組數學和統計學方法組成，可用于確定各因素及其交互作用在加工過程中對非獨立變量的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系，是一種優化反應條件和加工工藝參數的有效方法，由于其合理的設計和優良的結果，已被廣泛應用。該方法能克服正交設計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區域上因素的最佳組合和相應值的最優值的缺陷。本實驗表明，運用該方法研究海蓬子皂苷提取工藝參數，求得的回歸方程精度高，能實現多目標同步優化，結果較為準確可靠，具有實用價值。

3.2 α-葡萄糖苷酶在機體代謝中起著非常重要的作用，人體對淀粉等多糖類食物的最終消化和吸收都依賴它。而α-葡萄糖苷酶抑制劑可以競爭性抑制位于小腸內各種α-葡萄糖苷酶，使葡萄糖的生成和吸收減緩，從而降低餐后血糖峰值，調節血糖水平[22-23]，是臨床治療糖尿病的一類藥物。因此，從植物中尋找和篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑一直是降糖研究的熱點。結果表明，海蓬子皂苷提取物能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，且呈劑量依賴關系，提示海蓬子皂苷可能具有阿卡波糖樣的降血糖作用機制。

3.3 胰脂肪酶是水解膳食脂肪的關鍵酶，可水解50%～70%的食物脂肪。通過抑制胰脂肪酶活性可以減少人體對飲食中脂肪的水解和吸收，控制高血脂，對治療肥胖癥及預防其并發癥具有良好效果[24-25]。因此，開發和應用胰脂肪酶抑制劑作為減肥藥物備受關注。本實驗表明，海蓬子皂苷提取物是胰脂肪酶的高效抑制劑，其抑制率高達84.28%，IC50為1.01 mg/mL，應用價值極高。

綜上所述，采用響應面分析法優化海蓬子皂苷的提取條件合理可行；海蓬子皂苷是對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶有抑制活性的天然化合物，深入探討其作用機制及構效關系，對相關功能食品和藥物的研發有潛在意義。

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Optimization of Extraction Conditions for Saponin from Salicornia herbacea by Response Surface Method and Its Biological Activity

LIANG Bin, LI Juan, YU Jie*, CHEN Mei-zhen
(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

Response surface methodology was used to optimize the extraction process for saponins from young leaves of Salicornia herbacea. The saponions extracted were structurally characterized and evaluated for inhibitory effect on α-glucosidase and pancreatic lipase in vitro. Our results indicated that the optimal extraction conditions were material-toliquid ratio of 1:27 (g/mL), ethanol concentration (V/V) of 62%, and ultrasonification time of 30 min. Under these extraction conditions, maximum yield of saponins of 10.14 mg/g was obtained. Color reaction and infrared spectral analysis showed that the basic structure of saponins from Salicornia herbacea was tetracyclic triterpene saponin. The purified saponins had a strong inhibitory effect on both α-glycosidase and pancreatic lipase in vitro in a dose-dependent manner, and the maximum inhibitory rates were 68.20% and 84.28%, respectively. These results suggest that saponins from Salicornia herbacea may have similar hypoglycemic mechanism and hypolipidemic effect to acarbose.

Salicornia herbacea; saponin; response surface methodology; α-glycosidase; pancreatic lipase

TS209

A

1002-6630（2014）02-0102-06

10.7506/spkx1002-6630-201402019

2013-08-07

廣東省科技計劃項目（2010B020201015）；汕頭市科技計劃項目（2011-156）

梁彬（1988—），女，碩士研究生，研究方向為天然活性物質。E-mail：11bliang@stu.edu.cn

*通信作者：余杰（1955—），男，副教授，學士，研究方向為功能食品研究與開發。E-mail：jyu@stu.edu.cn