超聲波輔助酶法分離提取葡萄酒泥酵母SOD工藝條件的優化

杜 娜，楊學山*，韓舜愈，祝 霞，付文力，王 婧，盛文軍，張 波

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

超聲波輔助酶法分離提取葡萄酒泥酵母SOD工藝條件的優化

杜 娜1，楊學山2,*，韓舜愈1，祝 霞1，付文力2，王 婧1，盛文軍1，張 波1

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

以葡萄酒泥酵母為試材，超氧化物歧化酶（SOD）比活力為指標，在超聲功率、超聲時間、蝸牛酶質量濃度、酶解pH值和酶解溫度等單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化超聲波輔助蝸牛酶法提取SOD的工藝條件。結果表明：提取工藝因素對SOD比活力影響大小順序為超聲時間＞蝸牛酶質量濃度＞超聲功率＞酶解pH值＞酶解溫度，1 g濕酵母懸浮于5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，其提取SOD最佳工藝條件為超聲功率400 W、超聲時間12 min、2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、pH 6.6、溫度37 ℃，在此條件下，分離提取得到的SOD比活力達192.27 U/mg。結果表明超聲波輔助酶法在葡萄酒泥酵母SOD的提取中具有較高的應用價值。

葡萄酒泥酵母；超氧化物歧化酶；超聲波；蝸牛酶

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）廣泛分布于動物、植物和需氧微生物細胞內[1]，可維持體內超氧陰離子自由基的動態平衡，防止其對生物體的毒害[2]。SOD制劑在醫藥、食品及化妝品等方面具有廣泛的用途[3]。目前國內利用動物血液制備SOD取得了一定的成果，但存在原料來源受限，產品質量不穩定及潛在安全性風險等問題，因此利用微生物安全性較高、繁殖快、易大規模工業化生產等優點生產SOD成為了研究熱點[4-6]。

2011年我國葡萄酒年產量已達1.16×106kL，且保持年均10%～15%的增長速度[7]。在葡萄釀酒過程中會產生總加工酒量2%～4%的葡萄酒泥[8-9]，其中含有大量的酵母細胞。大多數生產企業將酒泥酵母直接丟棄或發酵后用作肥料，不僅浪費了寶貴的生物資源，而且會造成環境污染[10]。因此，利用葡萄酒泥酵母分離提取SOD，不僅可以獲得良好的經濟效益，而且能夠有效減輕葡萄酒生產企業的環保壓力。

利用葡萄酒泥酵母分離提取SOD國內外尚未見報道。馬森等[11]利用超聲波輔助提取啤酒廢酵母中活性成分，李永霞等[12]采用酶法結合機械破碎酵母提取肽酶，吳桂英等[13]運用高壓破碎酵母釋放乙醛脫氫酶，曾俊華等[14]介紹了乙酸乙酯處理酵母細胞，再采用擠壓法破碎酵母釋放腺苷蛋氨酸。結果顯示單一的破壁方法效果均不理想。超聲波可通過水介質的空化作用，使細胞壁結構發生破碎，釋放內容物[15-16]。蝸牛酶是從蝸牛的嗉囊和消化道中制備的混合酶，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶，可用于植物及酵母細胞壁的破碎[17]。因此本實驗以葡萄酒泥酵母為原料，采用超聲波輔助蝸牛酶酶解葡萄酒泥酵母細胞壁分離提取SOD，并對其工藝進行優化，以期為葡萄酒泥酵母資源開發提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒泥酵母 甘肅祁連葡萄酒業有限公司。

牛血清白蛋白 美國Pharmacia公司；蝸牛酶 金田生物科技有限公司；SOD活性測定試劑盒 南京建成生物工程有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、鄰苯三酚、檸檬酸鈉、山梨醇、Na2HPO4·12H2O、考馬斯亮藍均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SL-1001電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；TDZ5-WS離心機 湘儀離心機儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁有限公司；808型紫外-可見分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒泥酵母SOD提取工藝流程

葡萄酒泥→預處理→收集濕酵母→加入磷酸鹽緩沖液→超聲波處理→加入蝸牛酶→保溫處理→離心→熱變性→離心→提取液→SOD活性及蛋白質含量測定

1.3.2 操作要點

葡萄酒泥酵母預處理：收集足量的葡萄酒泥，與蒸餾水以1∶1比例混合，用80目的篩子進行篩分[18]，在4 000 r/min離心20 min，重復上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無色透明為止，收集沉淀備用；超聲波處理：以料液比1∶5（g/mL）將酵母懸浮于0.2 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液中，進行超聲波處理；蝸牛酶消化：在超聲波處理液中加入質量濃度1.0 mg/100 mL蝸牛酶液（蝸牛酶需用1.0 mol/L山梨醇等滲溶液溶解），控制溫度和pH值，酶解2 h，4 000 r/min離心20 min，收集上清液；熱變性：上清液45 ℃水浴20 min，4 000 r/min離心15 min，除去雜蛋白，即得SOD液。取樣進行SOD活性及蛋白質含量的測定。

1.3.3 單因素試驗設計

分別對不同超聲功率、超聲時間、蝸牛酶質量濃度、酶解pH值和酶解溫度進行單因素試驗，重復3次。以SOD比活力為指標，為正交試驗選擇因素水平。

1.3.4 正交試驗優化

根據單因素試驗結果確定葡萄酒泥酵母中提取SOD的正交試驗因素和水平，采用L9（34）正交試驗設計，優化超聲波輔助蝸牛酶法提取SOD的最優工藝，平行重復2次。

1.3.5 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[19]。通過實驗數據繪制的蛋白質標準曲線線性回歸方程為：y=0.004 9X－0.006 9（R2=0.998 9）。方程符合測定要求。

1.3.6 SOD酶活力測定

SOD活性測定試劑盒進行 。根據蛋白質含量和酶活力測定值計算SOD比活力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率對SOD比活力的影響

將1 g濕酵母分別懸浮于5 mL pH 5.8、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，分別在超聲功率為200、300、400、500、600 W條件下處理16 min，再加入質量濃度1 mg/100 mL的蝸牛酶液1 mL，37 ℃保溫2 h，離心后熱變性除去雜蛋白。SOD比活力測定結果見圖1。

圖1 超聲功率對SOD比活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on SOD specific activity

由圖1可知，隨著超聲功率的增加，SOD比活力在呈先上升后下降趨勢，400 W時達到最大值。其原因是，在超聲波作用時間一定時，超聲波的破碎作用主要取決于超聲功率，功率越大，其機械振動強度越大，酵母細胞壁破碎效果就越好，越有利于SOD釋放[20-21]，但超聲功率過大可能會導致酶分子結構變化，從而影響酶的活性。因此，選擇最佳超聲功率為400 W。

2.1.2 超聲時間對SOD比活力的影響

將1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液中，在超聲功率400 W條件下分別處理8、12、16、20、24 min，再加入質量濃度為1.0 mg/100 mL的蝸牛酶液1 mL，37 ℃保溫2 h，離心后熱變性除去部分雜蛋白。測定SOD比活力，結果見圖2。

圖2 超聲時間對SOD比活力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on SOD specific activity

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，SOD比活力先不斷升高，當超聲時間為16 min時達到最大值，隨后開始下降。因為適當的超聲時間，可以有效破壞酵母細胞壁的結構，有利于SOD釋放，但處理時間過長，可能會引起熱量積聚或機械剪切作用導致酶結構變化[22]，進而影響SOD比活力。因此超聲時間可控制在16 min左右。

2.1.3 蝸牛酶液質量濃度對SOD比活力的影響

將1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液中，超聲功率400 W處理16 min后分別加入質量濃度0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/100 mL的蝸牛酶液1 mL， 37 ℃水浴2 h，離心后熱變性。SOD比活力測定結果見圖3。

圖3 蝸牛酶質量濃度對SOD比活力的影響Fig.3 Effects of snailase dosage on SOD specific activity

由圖3可知，SOD比活力隨著蝸牛酶量的增加而增加，當蝸牛酶質量濃度增加至1.5 mg/100 mL時，SOD比活力達到最大值。當蝸牛酶量再增加時，SOD比活力開始下降。因為蝸牛酶中含有蛋白酶，過量的蝸牛酶在水解酵母細胞壁的同時，也可降解SOD[23-24]，這也是單一大量使用蝸牛酶進行酵母細胞破碎提取蛋白質類效果不佳的原因之一。綜合考慮結果及成本等因素，故最終選擇1.5 mg/100 mL蝸牛酶液為最佳質量濃度。

2.1.4 酶解pH值對SOD比活力的影響

將1g濕酵母分別懸浮于5 mL pH值為5.4、5.8、6.2、6.6、7.0的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，在超聲功率400W處理16 min后，加入質量濃度1.5 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL，37 ℃保溫2h，離心后熱變性。SOD比活力測定結果見圖4。

圖4 酶解pH值對SOD比活力的影響Fig.4 Effect of initial hydrolysis pH on SOD specific activity

由圖4可知，pH值對SOD比活力影響較大，當pH值小于或大于6.2時，酶的比活力都有所下降。這是由于當pH值為6.2時，既介于蝸牛酶的作用pH值（5.5～7.2）范圍內[25-26]，使酵母細胞破碎效果較好，又對SOD的活性影響較小，當pH值高于或低于6.2，SOD穩定性會受到一定影響，進而導致SOD比活力降低。

2.1.5 酶解溫度對SOD比活力的影響

將1g濕酵母懸浮于5 mL 0.2 mol/L、pH 6.2的磷酸鹽緩沖液中，超聲功率400W處理16 min后加入質量濃度1.5 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL，分別于31、34、37、40、43 ℃水浴2h，離心后熱變性，SOD比活力測定結果見圖5。

圖5 酶解溫度對SOD比活力的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on SOD specific activity

由圖5可知，隨著酶解溫度升高，SOD比活力逐漸增高，在37 ℃時達到最大值，超過37 ℃后酶活性開始下降，證明37 ℃為蝸牛酶液的最佳酶解溫度，與李永霞[12]、張培德[17]等的研究結果一致。

2.2 正交試驗優化

根據單因素試驗結果，選擇對SOD比活力影響較大的超聲功率、超聲時間、蝸牛酶質量濃度和酶解pH值進行L9（34）正交試驗，試驗設計及結果見表1。計算每一試驗組合的SOD比活力，并對試驗結果進行統計分析，得到最優組合后進行驗證實驗，確定超聲波輔助蝸牛酶法提取葡萄酒泥酵母SOD的最優工藝條件。

表1 L 1 L9（34）正交試驗設計及結果Table1 Lle1 L9(3(34) orthogonal array design arrangement and experimental results ) orthogonal array design arrangement and experimental results

從表1可以看出，分離提取葡萄酒泥酵母SOD影響因素的主次順序為B＞C＞A＞D，即超聲時間＞蝸牛酶質量濃度＞超聲功率＞酶解pH值。由K值可以確定最佳工藝組合為A2B1C3D3，即超聲功率400 W、超聲時間12 min、質量濃度2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、酶解pH 6.6。

用SPSS 17.0統計軟件對試驗結果進行方差分析，其結果見表2。

表2 正交試驗方差分析Table2 Analysis of variances for SOD specific activity with various extraction conditions

由表2可知，因素A、B、C在P＜0.05的水平上有顯著性差異，因素D酶解pH值不顯著。

2.3 驗證實驗

由于L9（34）正交試驗得到的最優組合在L9（34）正交試驗設計中未出現，因而需對正交試驗得到的最優組合進行驗證實驗。1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在超聲功率400 W、超聲時間12 min、質量濃度2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、酶解pH 6.6、酶解溫度37 ℃條件下提取SOD，重復3次。測得平均SOD比活力為192.27 U/mg，比正交試驗中最優組合得到的酶比活力高，可見正交試驗方差分析所確定的為最佳工藝參數。

3 結 論

本實驗以葡萄酒泥酵母為原料，通過不同單因素條件下的提取結果，對超聲波輔助蝸牛酶法提取葡萄酒泥酵母SOD主要影響因素進行L9（34）正交試驗優化，確定的最優工藝參數為1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，超聲功率400 W、超聲時間12 min、質量濃度2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、酶解pH 6.6、酶解溫度37 ℃，在此條件下提取SOD，所得平均SOD比活力為192.27 U/mg。該工藝具有工藝簡單、條件溫和、產品安全性高等特點，具有一定的應用前景。

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Optimization of Process Conditions for Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Superoxide Dismutase from Waste Wine Yeast

DU Na1, YANG Xue-shan2,*, HAN Shun-yu1, ZHU Xia1, FU Wen-li2, WANG Jing1, SHENG Wen-jun1, ZHANG Bo1
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The current work was designed to establish an optimal procedure for the extraction of superoxide dismutase (SOD) from waste wine yeast by ultrasonic-assisted snailase hydrolysis. Five process parameters, ultrasonic power, radiation time, enzyme concentration, pH and temperature were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design. The effects of these variables on SOD specific activity in extracts decreased in this order: radiation time ＞ enzyme concentration ＞ultrasonic power ＞ pH ＞ hydrolysis time. The optimal extraction conditions were found to be ultrasonic pretreatment at a power of 400 W for 12 min and subsequent hydrolysis with 1 mL of 2.0 mg/100 mL snailase solution at 37 ℃ with an initial pH of 6.6. Under these optimal conditions, the specific activity of SOD was 192.27 U/mg. The ultrasonic-assisted snailase hydrolysis procedure deserves further application in the production of SOD from waste wine yeast.

wine yeast; superoxide dismutase (SOD); ultrasound; snailase

TS261.9

A

1002-6630（2014）02-0087-04

10.7506/spkx1002-6630-201402016

2013-01-05

甘肅省科技支撐計劃項目（1104NKCA080）

杜娜（1988—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工利用。E-mail：dnxiaole88@163.com

*通信作者：楊學山（1977—），男，講師，碩士，研究方向為生物化學與生物產品開發。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn