牛源犬新孢子蟲IMP1基因的克隆與序列分析

張蕾，賈立軍，魯承

(延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉133002)

新孢子蟲病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲引起的多種家畜的一種原蟲病，該病可引起孕畜的流產、死胎，以及新生胎兒的運動障礙和神經系統疾病［1］。1988年Dubey等從癱瘓后肢的犬體分離了蟲體，將其命名為犬新孢子蟲［2］。犬新孢子蟲為專性細胞內寄生原蟲，隸屬于復頂亞門原生動物門新孢子蟲亞綱孢子蟲綱新孢子蟲屬。新孢子蟲病分布于世界各地，瑞士、挪威、芬蘭、哥斯達黎加、愛爾蘭、菲律賓、越南、泰國、以色列、俄羅斯、古巴等國都有因為新孢子蟲病引發母牛流產的事件［3］。該病給畜牧業造成了巨大的經濟損失，嚴重危害了養殖業的健康發展［4－5］。IMP1是2011年在巨型艾美耳球蟲內發現的一類具有免疫保護性的蛋白，但該蛋白的來源和功能尚不明確。Cui等對犬新孢子蟲IMP1基因蛋白進行了鑒定和定位的初步研究［6］。為了解牛源犬新孢子蟲IMP1基因的生物學特性，筆者對IMP1基因進行克隆與序列分析，旨在為IMP1基因的表達及后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與蟲株。Ecoli.DH5α 菌株、犬新孢子蟲吉林株和感受態，均來自延邊大學預防獸醫學實驗室。

1.1.2 主要試劑。DNA Marker2000、pMD18-T Simple Vector、XhoⅠ、Eco RⅠ和 ExTaq DNA 聚合酶，購自寶生物工程公司(大連);質粒提取試劑盒、蛋白酶K、溶菌酶和DNA凝膠回收試劑盒，購自OMEGA公司;其他試劑均為國產分析純級，市售。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計及合成。應用Primer Premier5.0及Oligo6.0軟件設計了一對引物P1、P2，引物由上海英駿生物技術公司合成。(P1)上游:5'CGGGATCCATGGGAGGCGTTTGCTCTAA 3';(P2)下游:5'CGGAATTCTTCAATGCCGGTCAGAAGC 3'。

1.2.2 IMP1基因的PCR擴增與鑒定。以犬新孢子蟲吉林株基因組DNA為模板，PCR反應總體系為25μl:2μl dNTP，模板 DNA 5 μl，上下游引物各 1 μl，Taq 酶 0.25 μl，2.5 μl 10×PCR Buffer，ddH2O 13.25 μl。優化 PCR 反應條件為:95℃預變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火1min，72℃延伸1 min，進行30個循環，最后72℃條件下延伸10 min。PCR反應結束后，將其產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 IMP1基因的克隆。用 pMD18-T Simple Vector與純化回收的IMP1片段進行連接，轉入E.coli.DH5α感受態細胞，涂布于LB固體培養基上(含有Amp抗性)篩選陽性菌落。

1.2.4 重組質粒的PCR鑒定與酶切鑒定。提取重組質粒DNA，應用P1、P2進行 PCR 鑒定;應用 Eco RⅠ和 Bam HⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.5 IMP1基因片段的序列測定與分析。將鑒定正確的陽性克隆質粒送往上海英俊生物技術公司進行測序，并使用分子生物學軟件DNAstar系統對測序結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增 以提取的犬新孢子蟲吉林株基因組DNA為模板，P1、P2為引物，擴增出片段長度為762 bp的IMP1基因片段(圖1)。

2.2 重組質粒pMD18-IMP1的鑒定 將IMP1基因與pMD18-T Simple Vector質粒連接，從而獲得重組克隆質粒pMD18-IMP1，進行PCR擴增，得到與目的基因片段大小一致條帶，說明重組質粒中含有IMP1基因。經Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切鑒定，得到762 bp的目的片段和2 692 bp的載體片段(圖2)，說明IMP1基因成功克隆到pMD18-T Simple Vector上。

圖1 目的基因PCR擴增結果

圖2 重組質粒pMD18-IMP1的酶切鑒定結果

2.3 重組質粒pMD18-IMP1的序列測定 測序結果表明，克隆得到的IMP1基因核苷酸長度為762 bp，編碼243個氨基酸。核苷酸序列197位上測序為A，而NCBI中為T，與Gen Bank(XM_003879531.1)中IMP1基因核苷酸的同源性為99.9%(圖3)。而氨基酸66位編碼的賴氨酸，突變之后編碼甲硫氨酸，氨基酸同源性為99.6%(圖4)。

圖3 IMP1基因序列與GenBank上(XM_003879531.1)序列同源性比較

圖4 IMP1基因編碼氨基酸序列的同源性比較

3 討論

禹海杰通過間接免疫熒光技術對弓形蟲速殖子不同時期IMP1蛋白的表達特性研究發現，在游離、吸附于細胞表面、入侵中、入侵后及納蟲空泡中的速殖子IMP1均有表達，均被定位于蟲體表面，且在有些蟲體的頂端表達更為強烈［7］。Cui等對犬新孢子蟲IMP1基因蛋白研究表明，IMP1基因蛋白編碼1 182 bp的開放閱讀框，編碼393個氨基酸，編碼的蛋白約42.9 kDa，該氨基酸序列沒有信號肽和跨膜區，但有9個酰基化位點和14個磷酸化位點。試驗選擇IMP1開放閱讀框內基因片段進行擴增與克隆，目的是為IMP1基因的表達和生物學特性的研究奠定基礎。

試驗對構建的IMP1基因重組質粒進行測序，得到的IMP1基因核苷酸長度為762 bp，編碼243個氨基酸。核苷酸序列197位上測序為A，而NCBI中為T，與GenBank(XM_003879531.1)中IMP1基因核苷酸的同源性為99.9%;氨基酸66位編碼的賴氨酸突變為甲硫氨酸，氨基酸同源性為99.6%，該突變是否對蛋白的表達及其他特性造成影響還有待于進一步研究。

［1］BJERKAS I，MOHN SF，PRESTHUSJ.Unidentified cyst-forming sporzoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs［J］.Zeitschr Parasitenkunde，1984，70(2):271 －274.

［2］DUBEY JP，CARPENTER JL，SPEERCA，etal.A newly recognized fatal protozoan disease of dogs［J］.JAm VetMed Assoc，1988，192(9):1269 －1285.

［3］OOIH K，H UANG C C，YANG C H，et al.Serological survey and first finding of Neospora caninum in Tai-wan，and the detection of its antibodies in various body fluids of cattle［J］.Veterinary Parasitology，2000，90:47 －55.

［4］鄧沖，張維，劉群，等.乳牛流產胎兒中新孢子蟲的鑒定［J］.中國獸醫科學，2007，37(1):16 －19.

［5］張守發，丁德，鞠玉琳，等.膠體金免疫層析法與ELISA法對牛的新孢子蟲血清抗體檢測結果的比較［J］.中國獸醫雜志，2008，44(8):54－55.

［6］CUIX，LEIT，YANGD Y，etal.Identification and characterization ofa novel Neospora caninum immunemapped protein 1 ［J］.Parasitology，2012，139(8):998－1004.

［7］禹海杰.弓形蟲疫苗候選抗原IMP1生物學特性及其免疫原性研究［D］.杭州:浙江大學，2013.