簡易－高鹽沉淀法提取云南松針葉DNA的條件優(yōu)化

袁曉慧，段安安，許玉蘭，2，劉惠民*

(1.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明650224;2.北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京100083)

云南松(Pinus yunnanensis)是分布于我國西南季風影響下的亞熱帶山地暖性氣候條件下的重要樹種，具有適應性強、耐干旱瘠薄以及木材用途廣泛等特點［1］，是我國西南特有種，也是組成滇黔桂亞熱帶山地針葉林植被的主要成分之一。其面積、蓄積量分別占云南省有林地面積、蓄積量的29.2%和15.8%，在云南林業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，對生態(tài)經(jīng)濟建設也具有舉足輕重的作用［2］。

高質量的基因組DNA是進行云南松遺傳多樣性研究及其他相關分子生物學研究的前提和基礎，是研究云南松種質資源、調查云南松基因多樣性以及制定有效保護措施的前提。云南松針葉中含有較多的松脂(萜烯類化合物)和酚類等次生代謝產(chǎn)物，這些物質容易與基因組DNA形成復合物，導致高純度的DNA的提取相對比較困難。將簡易提取法所得DNA充分溶解于TE后，再經(jīng)過高鹽沉淀法的進一步處理，可有效去除多糖和其他次生代謝雜質，獲得可滿足試驗要求的高質量的 DNA［3］。筆者采用正交試驗設計［4］，對簡易－高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的提取條件進行優(yōu)化，并以定性和定量檢測為指標，從而得出簡易－高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的最佳處理組合，以期為云南松分子水平的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。云南松針葉，采集于云南省昆明市西南林業(yè)大學格林溫室內種植的云南松新鮮幼嫩的針葉。

1.1.2 主要儀器。Beckman Avanti－30高速冷凍離心機，購自北京時代北利離心機廠;Synoptics Genegenius凝膠成像分析儀和Bio-Rad Pac-300電泳儀，購自Bio-Rad公司;微量紫外分光光度計，購自上海元析儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑。Tris和PVP，購自Sigma公司;β －巰基乙醇，購自Amresco公司;CTAB，購自Solarbio公司;TE緩沖液，購自生工生物工程(上海)有限公司;DL2000 Marker和Loading buffer，購自TaKaRa公司;100mmol/L Tris－HCL(pH 8.0)、1.4 mmol/L NaCl、20 mmol/L、EDTA、2%CTAB、3%PVP、3%β－巰基乙醇、氯仿、異戊醇、TE緩沖液(10 mmol/L Tris－HCL，pH 8.0;0.1 mmol/L EDTA)和無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 材料的采集及保存。隨機采集云南松當年生嫩針葉，平均分成16份，分別放入自封袋中，加入標簽，擠壓出自封袋內的空氣，置于－20℃的冰箱中保存。

1.2.2 DNA的提取。DNA提取的因素水平表見表1，設置水浴溫度、離心時間、V氯仿∶V異戊醇、NaCl濃度4 個因素，每個因素設置4個水平。提取步驟如下:①從冰箱中取出保存的云南松針葉樣品，取適量針葉放入研缽中，往研缽中迅速加入液氮研磨(液氮沒過針葉，一邊研磨一邊不斷加入液氮)，充分研磨至細粉末狀后，迅速裝入2 ml離心管中(裝到1/3處);②迅速往離心管中加入50μlβ－巰基乙醇和預熱(水浴溫度)的DNA提取液至刻度處，充分搖勻，放入水浴鍋中保溫50min，期間每隔10 min搖勻1次;③將離心管放入預冷(－4℃)的超速離心機中離心;④取上清液，加入等體積的氯仿:異戊醇，充分混勻后，將離心管放入預冷(－4℃)的超速離心機中離心;⑤重復步驟“④”2次后，取上清液，加入2.5倍體積預冷(－20℃)的無水乙醇;⑥在冰箱中靜置過夜后，將離心管放入預冷預冷(－4℃)的超速離心機中離心，倒掉上清液(注意不要將白色絮狀物倒掉);⑦將所得沉淀用濃度70%乙醇洗滌2次，風干后溶于100μl的TE中;⑧加入適量的NaCl溶液，使溶液中NaCl的終濃度達到所定標準，然后再次用無水乙醇將DNA沉淀出來，經(jīng)洗滌風干后，溶于100μl的TE緩沖液中。

表1 DNA提取的因素和水平

1.2.3 DNA質量檢測。待用TE緩沖液溶解的DNA解凍后，用濃度1%瓊脂糖凝膠在120 V恒壓下電泳40 min。電泳結束后在GeneGenins公司的Bio Imaging System上觀測并拍照和分析。結果統(tǒng)計參照何正文等［5］的方法，依擴增條帶的敏感性和特異性(即條帶強弱及雜帶的多少)計分，分數(shù)越高，表示DNA含量越高，所含雜質越少。

1.2.4 DNA的純度和濃度檢測。用微量紫外分光光度計對DNA的純度和濃度進行檢測，測定 OD260值、OD280值、OD260/OD280值，以此檢測DNA的質量，計算DNA濃度，若OD260/OD280值為1.7 ～1.9，表明 DNA 雜質污染較小，純度較好［6］;若比值 ＞1.9，則表明存在 RNA 的污染;若比值 ＜1.6，則表明有蛋白質、酚類等雜質的影響［7］。

2 結果與分析

2.1 云南松針葉DNA的質量 將圖1中條帶的強弱及雜帶的多少對16個處理組合進行打分，即條帶數(shù)量豐富、清晰度高、背景低的產(chǎn)物記為16分，而最差的記為1分。圖中1 ～16 處理組合計分分別為:13、9、14、11、12、7、9、6、7、16、7、12、5、3、11、15，并對不同因素與水平的電泳評分平均值和極差進行計算分析，結果如表3所示。極差R大小表明各因素影響程度的高低，R越大，說明該因素對結果影響越大。因此，在試驗范圍內，對試驗指標影響最大的因素是水浴溫度(C)，其次是離心時間(D)，再是 V氯仿∶V異戊醇(A)，最后是NaCl濃度(B)。根據(jù)k值確定各因素的最優(yōu)水平組合為:C3D1A3B3和 C3D1A3B4(表2)。

圖1 云南松針葉DNA電泳檢測結果

表2 正交試驗極差分析表

2.2 云南松針葉DNA的純度和濃度測定 用微量紫外分光光度計對DNA的濃度與純度進行檢測。由表3可知，處理組合10(C3D1A3B2)為最佳處理組合，所得DNA雜質污染較小，純度較好;其次是處理組合16(C3D2A4B4)。

表4 云南松針葉DNA的純度和濃度

3 結論與討論

提取高質量的DNA是現(xiàn)代生物技術研究中分子生物學試驗的第一步，也是關鍵的一步［8］，雖然采用試劑盒提取比較快捷，但價格昂貴［9］。正交設計篩選具有正交的均衡分散、綜合可比及可伸縮、效應明確等特性，在減少試驗規(guī)模的同時又不損失信息，能快速找到最優(yōu)組合，同時可分析不同因素對試驗結果的影響程度［10－11］。正交試驗設計對于多因素、多水平的試驗具有簡便、節(jié)省試驗單元且統(tǒng)計效率高等特點。

根據(jù)極差分析的結果，在試驗范圍內，對試驗指標影響最大的因素是水浴溫度(C)，其次是離心時間(D)，再其次是V氯仿∶V異戊醇(A)，最后是 NaCl濃度(B)，最佳處理組合為:C3D1A3B3和C3D1A3B4。

根據(jù)對濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果打分，結合用微量紫外分光光度計對DNA的濃度與純度進行檢測的結果，處理組合10(C3D1A3B2)、組合16(C3D2A4B4)所提DNA量大、污染少，其中以處理組合10(C3D1A3B2)最佳，這與極差分析的結果基本一致。大多數(shù)處理組合所提DNA溶液的OD260/OD280值大于1.9，表明存在RNA的污染。所以，在以后的研究中可以考慮加入RNnase，去除RNA，這樣，所得的DNA不僅量大而且所含雜質少，有利于后續(xù)研究。

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