生物發酵法處理病死豬后肺炎克雷伯菌效果的監測

王苗利 田夫林 陳 靜 王貴升 孫圣福 李玉杰 徐 鴻 尹斐斐 劉麗平 王世榮

生物發酵法處理病死豬后肺炎克雷伯菌效果的監測

王苗利 田夫林*陳 靜 王貴升 孫圣福 李玉杰 徐 鴻 尹斐斐 劉麗平 王世榮

（山東省動物疫病預防與控制中心 山東 濟南 250022）

本試驗利用細菌分離、培養、生化鑒定方法對臨沂沂水縣某豬場的病死豬生物發酵無害化處理堆的肺炎克雷伯菌進行了追蹤監測，結果表明，在21d的追蹤監測后，2組試驗中的肺炎克雷伯菌均已在7d后被殺滅，之后直至第21d均未再檢測到肺炎克雷伯菌。表明臨沂沂水縣某豬場采取的生物發酵法無害化處理病死豬對肺炎克雷伯菌的殺滅效果顯著。

細菌分離 生化鑒定 無害化處理 肺炎克雷伯菌

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是腸桿菌科常見的條件致病菌, 革蘭陰性,大小為0.3~1.5μm×0.6-6μm，單個成雙或短鏈排列，痰標本直接涂片，菌體呈卵圓形或球桿菌，單個或成雙排列．莢膜染色外周可見透明、環狀莢膜。隨著第三代頭孢菌素等廣譜抗菌藥的廣泛使用，產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)菌株不斷增多，成為臨床治療的難題之一[2]。因此，如何消滅病死豬攜帶的肺炎克雷伯菌，消滅傳染源，成為養殖場持續發展面臨的難題。

病死畜禽的無害化處理是消滅傳染源最有效和最徹底的措施，特別是當前正值重大動物疫病防控的重要階段和食用農產品質量安全水平全面提升的關鍵時期[3]。目前，養殖場對病死畜禽的處置方式主要有兩種，一是焚燒，無論用電或油均需要專門的設施設備，購置設備費用高，處理成本大，而且焚燒氣味大、有害成分多；二是深埋，多數養殖場(戶)對病死動物采用掩埋法，但掩埋的地點、深度和方法不符合有關規定。在夏季，被掩埋的動物尸體出現被雨水浸泡后溢出，還存在食肉動物扒出、被人偷掘挖出加工變賣等嚴重隱患，同時，多數掩埋地點不符合要求，容易污染周邊地下水源。因此，尋求有效、方便、環保的病死畜禽的無害化處理技術方法顯得尤為必要。

生物發酵床養豬技術起源于日本民間，在日本、韓國被大力推廣和廣泛應用，是近年我國引進的一項新興養豬技術，又稱“自然養豬法”、“零排放養豬法”或“生物環保養法”[4]。生物發酵床養豬技術是根據微生態理論，利用自然界的微生物資源，即自然界中多種有益微生物，通過選擇、培養、檢驗、擴繁，形成有相當活力的微生物母種，再按一定比例將其與鋸末、谷殼等輔助材料、活性劑等混合和發酵制成豬圈有機墊料。豬排泄出來的糞、尿被墊料掩埋，水分被發酵過程中產生的熱蒸發，使豬糞、尿中的有機物質得到充分的分解和轉化，達到無臭、無味、無害化的目的，是一種無污染、無排放、無臭氣的環保養豬技術[5]。但是目前尚無有關生物發酵法無害化處理病死動物對微生物殺滅效果的有關試驗及數據，因此，對生物發酵法無害化處理病死畜禽技術進行殺滅各類細菌的效果追蹤監測及評估勢在必行。

1 材料與方法

1.1 材料

法國科瑪嘉顯色定位培養基(批號LOT646)、麥康凱選擇培養基(批號1303271)、TSA培養基(批號20120829，青島高科園海博生物技術有限公司)、法國生物梅里埃ID32E生化反應條(批號1002551050)

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 本次實驗共對兩組堆體的樣品進行采集，分別為A組、B組，結合生產操作，于埋入病死豬前臟器病原菌分離、以及于0d、7d、14d、21d分別取樣。取樣位置按照堆體對角線至少布置3個點，每個采樣點分表層3~5cm、中心20~30cm、深部40~50cm進行取樣，每個樣品200g左右，塑料袋密封。試驗中，2組各采集12份樣品，每層采集4份。

在病死豬埋入前樣品的采集，遵循操作安全、無菌，采樣由小到大、病變與健康組織兼顧的原則。脾、腎、淋巴結可以采取完整的一個。肝、肺等可以采集病變和健康組織交界處，至少5×5cm大小。腸或氣管，采集帶病變部位至少5cm長。

1.2.2 細菌分離、鑒定 將2組病死豬的臟器樣品以及發酵堆每周采集的樣品按照細菌學無菌操作接種于麥康凱培養基和科瑪嘉顯色定位培養基上，將平板倒置放于37℃的溫箱培養18~24h，后拿出觀察菌落形態。肺炎克雷伯菌在麥康凱形成隆起、大而粘液樣融合一起的粉紅菌落，用接種環挑起呈絲狀粘連；在科瑪嘉顯色定位培養基上生長為藍色圓形菌落。挑取可疑菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，若為革蘭陰性桿菌，單個成雙或短鏈排列，則初步判定為肺炎克雷伯菌。挑取可疑菌落接種在TSA固體培養基上，37℃的溫箱培養18~24h，純化出單菌落，按照無菌操作要求接種到法國生物梅里埃ID32E生化反應條上，37℃的溫箱培養18~24h，進行生化試驗結果的判讀。

2 結果與分析

2.1 細菌生化鑒定結果

將2組病死豬的臟器樣品以及發酵堆每周采集的樣品接種到麥康凱選擇培養基上培養18~24h后，形成隆起、大而粘液樣融合一起的粉紅菌落，用接種環挑起呈絲狀粘連，革蘭氏染色后鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，在科瑪嘉顯色定位培養基上生長為藍色圓形菌落，疑似肺炎克雷伯菌。2組樣品的可疑菌落接種到法國生物 梅里埃ID32E生化反應條上，經37℃的溫箱培養18~24h后，讀取結果表明，2組發酵堆均分離到了肺炎克雷伯菌。生化結果見表1(A組)、表2(B組)。

表1 A組發酵堆分離出的肺炎克雷伯生化譜

表2 B組發酵堆分離出的肺炎克雷伯生化譜

2.2 肺炎克雷伯菌殺滅效果追蹤結果

通過對A組、B組不同采樣時期的樣品全部進行肺炎克雷伯菌檢測鑒定后，發酵堆對肺炎克雷伯菌的殺滅效果明顯，結果見表3。

表3 A組、B組發酵堆對肺炎克雷伯菌的殺滅效果

3 結論

由試驗結果可知，2組無害化處理后，肺炎克雷伯菌均已在7d后被殺滅，之后直至第21d均未再檢測到肺炎克雷伯菌。結果表明，臨沂沂水縣某豬場采取的生物發酵法無害化處理病死豬對肺炎克雷伯菌的殺滅效果顯著。

4 討論

被丟棄的病畜禽尸體其所帶的細菌、病毒會隨空氣或其他途徑迅速傳播擴散，如果是重大動物疫病或人畜共患病，會造成重大動物疫情或人畜共患病發生，人畜生命安全就會受到威脅，經濟就會受到嚴重損失，影響畜牧養殖業的發展[1]。

近年來，山東省省的養豬場雖然沒有發生重大動物疫情，但全省豬疫病病種多、病原復雜、污染面廣、隱性帶毒的現象仍然存在，重大動物疫情發生的風險仍然很大，肺炎克雷伯等人畜共患病有出現局部散發乃至流行的可能，豬偽狂犬病等其他動物疫病也存在局部流行的風險。隨著畜牧業生產規模不斷擴大，養殖密度不斷增加，豬感染病原機會增多，病原變異幾率加大，新發疫病發生風險增加。因此，開展生物發酵法病死豬無害化處理是發展生態畜牧業的需求，追蹤監測生物發酵無害化處理技術對病原微生物的殺滅效果，為開展病死豬無害化處理的研究提供理論依據。

生物發酵床養豬因其眾多的優點受到國內外廣大養殖戶喜愛，但在實際應用過程中也存在一些不足的地方，例如夏季發酵舍內溫度過高，若通風不好，將會導致工作人員的工作環境較為惡劣，因此，相關的工作人員要做好相應的防護。另外，如何進一步提高生物發酵無害化處理病死豬的微生物殺滅效果，并進行推廣，有待于進一步研究。

[1] 鄧敏, 劉瑩, 曾吉等. 肺炎克雷伯菌分布特征及耐藥性分析[J]. 中國抗感染化療雜志, 2001, 1(2): 98-99.

[2] 王聯芳, 朱新華. 病死畜禽無害化處理存在的問題及對策[J]. 醫學動物防制, 2008, 24(11): 876-877.

[3] 杜曉光，武俊海. 發酵床養豬PK農村戶用沼氣[J]. 中國動物保健, 2008(5): 26-28.

[4] 武華玉, 喬木, 彭先文等. 對生物發酵床養豬技術的認識[J]. 畜牧與飼料科學, 2009, 30(6): 101-102.

[5] 方煥森. 淺談對病死畜禽無害化處理過程中存在的問題及對策[J]. 中國畜牧獸醫文摘, 2011, 27(5): 2-2.

病死畜禽無害化處理技術推廣項目，豬產業體系創新團隊項目

（2014–02–12）

S818.9

A

1007-1733(2014)05-0012-02