狐貍支氣管敗血波氏桿菌的分離與鑒定

秦緒偉

狐貍支氣管敗血波氏桿菌的分離與鑒定

秦緒偉

（齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

本試驗是從山東菏澤某狐貍養殖場發病狐貍分離到一株細菌，經生化試驗、PCR、16sRNA測序最終確定為支氣管波氏桿菌，經動物試驗確定為致病性波氏桿菌，經藥敏試驗選擇阿奇霉素作為理想的藥物，最終取得良好的治療效果。

狐貍 支氣管波氏桿菌 分離 藥敏試驗 鑒定

支氣管敗血波氏桿菌屬于波氏桿菌屬，普遍存在于多種動物，常會引起兔子的波氏桿菌性鼻炎、豬的萎縮性鼻炎[1]，特別是兔子感染率、死亡率都較高[2]，給養殖場帶來極大的損失。兔子、豬、犬波氏桿菌病有人報道，但是狐貍的波氏桿菌少見報道，毛皮動物養殖業這幾年發展迅速，許多動物的下腳料都成為了毛皮動物的肉類食物，盲目擴群但環境衛生管理不善，引起各種疾病發生，本實驗從山東菏澤一狐貍養殖場發病狐貍分離到一株細菌，經一系列生化試驗、PCR、基因測序、毒力試驗確定為支氣管敗血波氏桿菌，經藥敏試驗，采取加強管理、藥物注射方式取得了良好的效果，控制了疫情。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 山東菏澤一800只狐貍養殖場。發病狐貍精神沉郁，食欲減退，咳嗽、甩鼻、流涕，發病狐貍經解剖無菌條件分離肺臟、氣管，獲得一株細菌。

1.1.2 其他材料 營養瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂培養基等購自青島海博生物技術有限公司；微量生化試劑管購自北京路橋技術有限責任公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司；PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；實驗室其他常規試劑。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養 對發病狐貍解剖，無菌條件下取肺和氣管環內容物，接種于血清營養瓊脂，在37℃恒溫培養箱培養48h，培養出的細菌挑取單個菌落進行純化，同時接種麥康凱瓊脂培養基，觀察菌落形態。

1.2.2 細菌的生化試驗 血清平板挑取單個菌落，接種于馬丁肉湯培養基培養，在37℃恒溫培養箱培養48h，分別取0.2ml接種于乳糖、葡萄糖、水楊苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇等微量生化反應試管，24h后觀察生化反應結果。

1.2.3 細菌的分子生物學鑒定 （1）16S rRNA：無菌挑取平板上的菌落加入到1ml無菌水中，震蕩混勻后沸水浴7min，冰浴5min，離心上清作為基因擴增的模板，設計引物：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’，PCR反應體系(50ml)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500 mmol/L)5ml，2.5mmol/L dNTP 4ml，引物(20umol/L)各1ml，模板2ml，ddH2O36.8ul，Taq酶(5U/ml)0.25ml。PCR反應條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30個循環；72℃ 10min。取PCR產物5ml用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物送交上海基因測序公司進行測序，將測序結果提交Genbank進行比對，構建系統發育樹，判定細菌的系統發育地位，以97%相似性為界限判定為何種菌。（2）種特異性PCR。根據支氣管敗血波氏桿菌鞭毛蛋白基因設計引物Fla1：TGG CGC CTG CCC TAT，Fla2：AGG CTC CA AGA GAG AAA GGC TT進行PCR擴增。細菌DNA提取用熱裂解法。PCR反應體系(50ml)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol /L)5ml，2.5mmol/L dNTP 4ml，引物(20umol/L)各1ml，模板2ml，ddH2O36.8ml，Taq酶(5U/ml)0.25ml。PCR反應條件：94℃ 3min；94℃ 1min，56℃ 45s，72℃ 1.5min，35個循環；72℃ 10min。取PCR產物5ml用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴增出的片段大小。

1.2.4 細菌的藥敏試驗 使用藥敏紙片法對分離的細菌進行藥敏試驗，培養過夜后量取抑菌圈的直徑，判定該菌的耐藥性。。

1.2.5 細菌的毒力試驗 在營養瓊脂平板無菌取單個菌落，接種于馬丁肉湯培養基，37℃恒溫搖床培養箱培養48h，分別取培養液原液和100倍稀釋液注射18g~22g小白鼠各3只，0.3ml/只，腹腔注射，注射后觀察7d，對照組3只，若有死亡對死亡的小白鼠解剖再進行細菌分離。

2 結果

2.1 細菌培養結果

無菌分離病狐貍的氣管、肺，血清平板上37℃溫箱48h培養可見圓形、稍微隆起、奶油樣灰白色菌落，轉接后在麥康凱上37℃溫箱48h培養可見圓形藍灰色、光滑、隆起的菌落，周圍有狹窄的紅色環；馬丁肉湯震蕩培養24h可見液體混濁，圖片鏡檢可見革蘭氏染色陰性，桿狀或者球桿狀，形態較小，有莢膜無芽孢。

2.2 細菌的生化結果

將分離菌進行了微量生化試驗，試驗結果表明該菌對乳糖、葡萄糖、水楊苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖等糖醇類都為陰性，氧化酶、脲酶、利用檸檬酸、還原硝酸鹽、運動性都為陽性。具體結果見表1。

表1 分離菌生化鑒定結果

注：“—”表示陰性，“+”表示陽性

2.3 細菌的分子生物學鑒定結果

2.3.1 16S rRNA結果 根據上海測序公司的測序結果，采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對序列進行人工校對，然后輸入Genbank用Blastn軟件進行相似性比較，最后利用構建系統發育樹，與支氣管波氏桿菌相似性為99.9%，最終確定為支氣管波氏桿菌。

2.3.2 種特異性PCR結果 電泳后擴增出了237bp左右的片段，符合支氣管波氏桿菌的相應大小的片段。

2.4 細菌的藥敏試驗結果

將波氏桿菌涂布于血清營養瓊脂平板，把標記好的藥敏片貼于血清平板，最終根據抑菌圈的大小判定藥物的敏感程度，其中阿奇霉素、頭孢噻呋、左氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星高度敏感；壯觀霉素、慶大霉素、鏈霉素、復方新諾明、林可霉素、萬古霉素、磷霉素不敏感。最終選擇阿奇霉素作為治療藥物。具體藥敏結果見表2。

表2 分離菌的藥敏結果 （mm）

2.5 毒力試驗結果

無菌挑取單個菌落接種于馬丁肉湯培養基，37℃恒溫培養24h后進行細菌計數，計數為25億/ml，將細菌原液和100倍稀釋液分別注射小白鼠3只，注射原液組第3日全部死亡，100倍稀釋液注射后7d無死亡，即7.5億細菌對小白鼠有致死性毒力，750萬細菌對小白鼠沒有毒力，分離菌屬于中等毒力。

3 討論

3.1 狐貍波氏桿菌的分離

波氏桿菌初次分離生長緩慢，此次細菌分離培養18h未見明顯的菌落，在培養36~48h可見針尖大小的透明的菌落。在分離細菌時不能過夜后沒有見到細菌就放棄分離，那樣會錯過分離到波氏桿菌的機會。此次細菌分離經解剖、生化試驗、PCR等方法最終診斷為支氣管敗血波氏桿菌，毒力屬于中等毒力。

3.2 狐貍波氏桿菌的診療

此次病例養殖場狐貍以咳嗽、甩鼻、流涕為主要特征，發病較快、發病率高、死亡率較低，解剖后可見肺部出血、氣管環內大量膿性粘液，通過一系列的細菌分離、生化試驗、PCR、基因測序等實驗室診斷最終確診為支氣管敗血波氏桿菌，根據藥敏試驗選擇了阿奇霉素作為治療的首選藥物，通過連續3d的治療取得了良好的效果，咳嗽、甩鼻的狐貍明顯減少，最終控制了疫情。狐貍的波氏桿菌報道的很少，一般不作為致病主因，在臨床上也不容易確診，發現咳嗽、甩鼻、流涕為主要特征時一般按照普通的感冒治療，有時候效果不理想，咳嗽增多、食欲下降、生長緩慢，在臨床上發現多例類似病例，特別是秋冬交替的季節發病較多，按照藥敏試驗選擇敏感的藥物，另外配合止咳、平喘、化痰的藥敏治療效果比較明顯，按照療程治療一般死亡率都較低。

3.3 狐貍波氏桿菌的預防

波氏桿菌主要侵害呼吸道，特別是應激的條件下多發，季節交替、天氣變化、陰雨連綿、轉群等條件下經常可以見到，表現為咳嗽、流涕，在實際的生產中我們要降低各種應激，在可以預見的應激來臨之前可以使用電解多維、葡萄糖、VC等藥物來降低應激，另外要保持環境衛生、清理糞便、定期消毒，控制病原菌的傳播。兔子有波氏桿菌的疫苗，但還是時有發生，狐貍沒有波氏桿菌的疫苗預防，還要從環境等因素進行預防，防止疾病的發生。

[1] 陸承平. 獸醫微生物學第5版[M]. 北京: 中國農業出版社, 2013, 155-157.

[2] 謝三星. 獸醫全攻略兔病[M]. 北京: 中國農業出版社, 2009, 128-132.

（2014–01–21）

S858.92

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1007-1733(2014)05-0008-02