某蛋用型父母代雞群種蛋中禽白血病病毒的檢測

王海燕 李志松 李志杰

某蛋用型父母代雞群種蛋中禽白血病病毒的檢測

王海燕 李志松 李志杰

（山東省壽光市紀臺鎮畜牧獸醫管理站，262722） （山東省壽光市畜牧獸醫管理局） （山東畜牧獸醫職業學院 山東 濰坊）

為了檢測某蛋用型父母代雞群是否存在外源性禽白血病病毒(ALV)的感染，收集該雞群的92枚雞胚，每枚雞胚無菌取蛋清2份，一份用禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒直接檢測群特異性p27抗原，同時分別將92枚雞胚蛋清接種DF1細胞，培養維持8d后取細胞上清檢測p27抗原。將p27抗原陽性樣品，分別用針對ALV-J和ALV-AB的單因子血清做間接免疫熒光檢測(IFA)。比較p27陽性檢出率。結果表明，直接檢測蛋清的檢出率高于蛋清接種DF1后的細胞上清，接種DF1細胞后p27抗原陽性樣品的IFA檢測結果顯示ALV-J的陽性率為100%，ALV-AB全部為陰性。說明該蛋用型父母代雞群存在的外源性ALV感染主要是ALV-J，該研究為針對ALV的凈化提供了可行性檢測方法。

父母代 種蛋 禽白血病病毒 p27抗原 間接免疫熒光

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus，RSV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統稱。本病除了腫瘤等一些特殊病變外，常繼發細菌感染或嚴重干擾對雞新城疫、禽流感等疫苗的免疫效果，而且還常常通過種蛋引發垂直感染，引起諸多糾紛。

從20世紀60年代起，國際大型種雞公司已開始對ALV實行嚴格的凈化措施，主要是通過剔除感染種雞，切斷垂直傳播途徑并將后代隔離飼養。經過多年的努力，到80年代中期，在商業化雞群中外源性ALV感染已基本被清除，很少被檢測到。1989年，在白羽肉用型雞群中又出現了具有更強致病性和傳播能力的ALV-J，并流行到世界各地，給世界肉雞產業帶來了巨大的經濟損失[1-3]。近幾年來，我國各地蛋雞場在雞群開產后發生禽白血病/血管瘤的病例顯著增多，該病已成為影響我國蛋雞業的重要疫病之一。病毒分離鑒定表明，近年來在我國產蛋雞開產后發生的白血病/血管瘤主要是由ALV-J引起，但也同時也大量存在由A、B亞群ALV感染引起。實際上，ALV-J的流行狀況，最初主要表現在從國外引進的白羽肉用型種雞[4,5,6]，隨后發現ALV-J在我國蛋用型雞[7,8,9,10]、南方的三黃雞[11]和我國的純地方品系[12,13]中也開始引發骨髓樣細胞瘤的廣泛流行。本研究從某疑似感染ALV的父母代種雞場種蛋中完成了對ALV的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與背景 某海蘭褐父母代蛋雞種雞場剖檢多次觀察到腫瘤，懷疑感染有ALV。為了確認并評估本雞群ALV感染的風險，從該種雞場隨機采集種蛋92枚。以無菌操作的方式，每枚雞胚取2份蛋清，置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑與試劑盒 ALV-J和A/B單因子血清由本實驗室制備和保存，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗雞二抗購自SIGMA公司。DF-1細胞購自ATCC并由本實驗室保存，小牛血清購自大理鄧川錦洋生物工程公司。禽白血病病毒p27抗原ELISA檢測試劑盒購自美國IDEXX公司。

1.3 蛋清ALV-p27抗原的直接檢測 將凍存的蛋清反復凍融3次后用禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒檢測ALV的群特異性抗原p27，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 蛋清接種細胞后ALV-p27抗原的檢測 將92份蛋清，用在4℃預冷的細胞維持液進行5倍稀釋(用2ml細胞維持液稀釋500ul的蛋清)接至含DF1單層細胞的24孔板上,每孔1ml,每份樣品接1孔,同時設陰性對照。接種的細胞在37℃培養箱中孵育2h后棄掉培養上清液，更換成含1%新生小牛血清的DMEM維持液；繼續在37℃培養箱中培養7d后，收集培養上清液，反復凍融3次，取200uL用IDEXX公司ALV-p27抗原檢測試劑盒檢測p27抗原。

1.5 ALV-J和ALV-A/B的IFA檢測 將DF1細胞培養的經ELISA試劑盒檢測p27為陽性的蛋清樣品，分別傳至帶有飛片的六孔板中，繼續培養3d后，將飛片取出固定后分別用ALV-J和ALV-AB的單因子血清做IFA檢測[23]。

2 結果與分析

2.1 種蛋中ALV-p27抗原的檢測結果比較 92枚雞蛋蛋清直接檢測ALV p27抗原的陽性率為36.96%。而92份蛋清接種DF-1后p27抗原檢測結果顯示，4份樣品為陽性，顯示該雞群存在外源性ALV感染，陽性率為4.35%。比較p27陽性檢出率的結果表明，直接檢測蛋清的檢出率高于蛋清接種DF1的細胞上清，這說明存在大量的內源性ALV的表達。結果見表1。

表1 蛋雞場種蛋中p27抗原的陽性比率

2.2 IFA檢測ALV-J，ALV-A/B與ELISA檢測p27抗原的結果比較 IFA檢測結果表明，4份經DF1培養的ALV陽性樣品有4份為ALV-J陽性。與未感染ALV-J的樣品相比，陽性樣品的胞質內均有明顯的特異性綠色熒光，細胞核未被染色呈現灰暗色；ALV-AB均為陰性。IFA與p27抗原的ELISA檢測結果比較表明,該雞群中存在的ALV感染主要為ALV-J。結果見表2。

表2 IFA檢測ALV-J、ALV-AB與ELISA檢測p27抗原的比較結果

3 討論

ALV引起的腫瘤病是目前危害養雞業的主要疾病之一，已在世界范圍內呈蔓延。近幾年來，不斷有蛋雞感染禽白血病的報道[14,7,8,9,10]，許多種雞場都很關心蛋雞禽白血病的感染來源，對種雞群進行檢測與凈化已經勢在必行。國際大型蛋用型祖代雞場公司盡管一直在實施ALV的凈化措施，但卻不能完全排除外源性ALV的感染，并且美國已有報道證明，近年來在美國市場上使用的幾種馬立克疫苗中都檢測出了ALV的污染[15,16],相關種禽企業可能使用了這些疫苗，從而造成了ALV的感染。鑒于ALV的垂直傳播特性，這些企業即使在發現感染后重新采取凈化措施，也不能保證在幾年內就實現100%的凈化。本研究采集某蛋雞場父母代雞群的92枚種蛋對ALV進行了檢測，評價了該蛋雞場父母代雞群ALV的感染狀態。

所有ALV檢測方法中，ELISA最為常用，而DF1對內源性ALV有抗性，可區分有致病性的外源性ALV，對種蛋蛋清接種DF1培養后的細胞上清的ELISA檢測可用于剔除內源性ALV感染的種雞。本研究采用ELISA方法檢測了92枚種蛋蛋清ALV-p27抗原與92枚種蛋蛋清接種DF1細胞上清中的ALV-p27抗原。比較p27抗原陽性檢出率的結果表明，直接檢測蛋清的檢出率高于蛋清接種DF1的細胞上清。由于ALV對外界的抵抗力很弱，在運輸、取樣或接種過程中會由于溫度等外界因素而失去傳染性，而蛋清中的p27屬于衣殼蛋白，不易變性，故直接檢測蛋清p27的陽性率會遠遠的高于檢測蛋清接種細胞的細胞上清p27，因此采用種蛋蛋清直接檢測ALV-p27的方法檢測ALV更加有利于ALV陽性蛋雞的及時剔除，而且該研究方法較經典的采集抗凝血進行病毒分離的方法更為簡便。對4份經DF1培養的外源性ALV陽性樣品分別用ALV-J和ALV-A/B單因子血清進行的IFA檢測結果顯示，4份ALV-J均呈陽性，ALV-AB均呈陰性。表明，該蛋用型雞場父母代雞種蛋中感染的外源性ALV為ALV-J。

本研究通過對某父母代蛋雞種蛋蛋清中ALV-p27抗原及細胞培養后p27抗原的檢測，評價了該蛋雞場父母代雞群ALV的感染狀態,為不同種雞群ALV的凈化提供了可行性方法，同時提供了禽白血病防控技術體系所需的實驗室檢測依據與可靠的流行病學資料。

[1] Payne L N, Brown S R,et al. A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens[J]. J Gen Virol, 1991, 72: 801-807.

[2] Payne L N, HowesK, et al. Host range of Rous sarcoma virus pseudotype RSV(HPRS-103)in 12 avian species: support for a new avian retrovirus envelope subgroup, designated J[J]. J Gen Virol, 1992, 73: 2995-2997.

[3] Coffin J M.Structure and Classification of Retroviruses.In J.A.Levy, (Ed), New York:Plenum Press. 1992. The Retroviridae, vol.1(pp.19-49).

[4] 杜巖, 崔治中等. 雞的J亞群白血病病毒的分離及部分序列比較[J]. 病毒學報. 2000, 16: 341-346.

[5] Cui Z, Du Y, et al. Comparison of Chinese field strains of avian leukosis subgroup J viruses with prototype strain HPRS-103 and United States strains[J]. Avian Dis,2003, 47, 1321-1330.

[6] 張志, 崔治中等. 商品代肉雞J亞群禽白血病的病理及病毒分離鑒定[J]. 中國獸醫雜志, 2002,38: 6-8.

[7] Xu B, Dong W, et al. Occurrence of avian leukosis virus subgroup J in commercial layer flocks in China[J]. Avian Pathol, 2004,33(1): 13-17.

[8] 王輝, 崔治中等. 蛋雞J亞群白血病病毒的分離鑒定及序列分析[J]. 病毒學報, 2008, 24: 369-375.

[9] 成子強, 張利等. 中國麻雞中發現禽J亞群白血病[J]. 微生物學報, 2005, 45: 584-587.

[10] 何愛飛, 徐春志等. 蛋雞血管瘤型禽白血病的診斷[J].動物醫學進展, 2009, 30(1): 112-115.

[11] Sun S, Cui Z. Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in Chinese local”yellow” chickens[J]. Avian Pathology. 2007,36(3): 221-226.

[12] 秦愛建, 崔治中等. 抗J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特異性單克隆抗體的研制及其特性[J]. 畜牧獸醫學報, 2001, 32(6): 556-562.

[13] 張洪海, 劉青等. 地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J].畜牧獸醫學報, 2009,40(8): 1215-1221.

[14] Purchase, HG., D.G.Gilmour, C.H.Romero, andW. OkaZaki. 1977. Post infeetion genetic Resistance to avian lymPhoid leukosis resides in a B traget cell.Nature270:61-62.

[15] 徐鎮蕊, 董衛星, 何召慶等. 間接熒光抗體法快速診斷海蘭褐蛋雞J亞群禽白血病的研究[J]. 中國獸醫雜志, 2002, 38(6): 6-8.

[16] Cottal, G, E., B. R. Burmester, and N.F. Waters. Egg transmission of avian lymphomatosis. Poult Sci 1954，33:1174-1184.

[17] deBoer, G.F., 0.J.H.Devos, and H.J.L. Mass.The incidence of lymphoid leukosis in Chiekens in the Nether lands.Zooteehniea Int 1981, 10: 32-35.

[18] 徐鎮蕊, 董衛星, 何召慶等. 間接熒光抗體法快速診斷海蘭褐蛋雞J亞群禽白血病的研究[J]. 中國獸醫雜志, 2002, 38(6): 6-8.

[19] 徐鑌蕊, 董衛星, 余春明. 蛋雞J亞群禽白血病的分子生物學診斷[J]. 病毒學報, 2005. 21(4): 289-292.

[20] 崔治中. 雞白血病及其鑒別診斷和預防控制[A]. 雞淋巴白血病防控技術研討會論文集[C], 山東農業大學. 2010. 1-12.

[21] Sandelin K.and Estola T..Testing and management of a specific pathogen free chicken flock with special reference to avian leukosis virus infections[J]. Acta Veterinaria Scandinavica, 1975. 16: 341-356.

[22] 楊玉瑩, 葉建強, 趙振華等. J亞群禽白血病病毒的分離與鑒定[J]. 中國病毒學, 2003. 18(5): 46-50.

[23] Qin A, Lee LF, Fadly AM, et al. Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup J avain leukosis. Avian Dis, 2001, 45: 938-945.

（2014–03–31）

S858.3

A

1007-1733(2014)05-0006-03