維生素C對酮康唑抑制白色念珠菌的影響研究

張祥濤 于立權

維生素C對酮康唑抑制白色念珠菌的影響研究

張祥濤 于立權*

（山東聯創建筑(礦業)設計有限公司 山東 濟南 250000） （黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院 黑龍江 大慶）

為研究酮康唑治療畜禽真菌感染過程中能否給與維生素C輔助治療，體外測試了添加維生素C后白念珠菌對酮康唑的敏感性。結果發現，維生素C能顯著抑制酮康唑對白色念珠菌的敏感性，為科學治療畜禽機會性真菌臨床感染提供了依據。

維生素C 酮康唑 白色念珠菌

白色念珠菌(Candida albicans)是臨床重要的條件致病性真菌[1]，在獸醫臨床廣泛存在。由于抗生素、皮質激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛使用和濫用，以及用藥消毒不嚴格、飼舍衛生差、畜禽營養不良等因素，像頑固性奶牛乳房炎[2]、奶牛子宮內膜炎[3]和禽消化道真菌病[4]等畜禽條件性念珠菌病越來越多，往往會造成誤診或漏診，給獸醫臨床診治帶來嚴重困擾。

酮康唑屬吡咯類抗真菌藥，對深部感染真菌如念珠菌屬等具有抗菌作用，是臨床常用的抗真菌藥[5]。L-抗壞血酸(VC)是一種水溶性維生素，可以保護如谷胱甘肽等抗氧化劑，發揮抗氧化作用[6]。為此，本文對抗壞血酸對酮康唑抑制白念珠菌的影響進行了研究，以期指導白念珠菌病的臨床治療，為畜禽白念珠菌病的防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養基 白色念珠菌RM1000，由黑龍江八一農墾大學生命院4056實驗室提供；YPD培養基用胰蛋白胨和酵母提取物為OXOID公司產品，營養瓊脂為北京奧博星生物技術責任有限公司產品。Vc為天津市博迪化工有限公司產品；谷胱甘肽(L-GSH，還原型)為山東西亞化學工業有限公司產品；酮康唑(KCZ)為成都貝斯特試劑有限公司產品。

1.2 培養基及試劑配制 液體YPD培養基(2%胰蛋白胨；1%酵母提取物；2%葡萄糖)，固體YPD培養基添加2%的瓊脂粉，121℃滅菌20min備用。分別配制0.5M的Vc、0.5M的GSH和10μg/ml的KCZ貯存液，4℃保存備用。

1.3 菌株生長期測試 取白色念珠菌RM1000，無菌操作臺內劃線法YPD平板接種活化，標記后30℃恒溫培養。挑新鮮單菌落接種于2-3ml YPD液體培養基中180rpm過夜培養后，按1:100(v/v)比例轉接新鮮的YPD液體培養基，間隔2h取樣，測OD600，共記錄至58h。

1.4 添加Vc后菌株對KCZ的敏感性測試

按照上述方法，按照1:100(v/v)的比例接種菌液于新鮮的YPD液體培養基后，加入終濃度5mM的Vc和100ng/ml的KCZ(KCZ+Vc組)，分別在作用0、0.5、1、6、12、24、36和48h后，取1ml菌液，5000rpm離心后，1ml滅菌ddH2O重懸，取100ml重懸液加入到900ulddH2O中，充分漩渦后，取100ml懸浮液涂布于YPD平板，30℃培養，計數。同時，設置KCZ+Vc+GSH、Vc+GSH、Vc、GSH、KCZ和ddH2O 6個對照組。

2 結果

2.1 菌株RM1000不同生長期的確定 首先測試了白念珠菌RM1000菌株的生長期。結果發現，白念珠菌菌株RM1000在30h達到對數生長期，OD值達到最大值(圖1)，為后續進行酮康唑敏感性測試實驗奠定了基礎。

圖1 白色念珠菌菌株RM1000的生長曲線

2.2 體外添加Vc影響白念菌RM1000對KCZ的敏感性 參照公開發表的文獻[7]，選用添加5mM Vc進行測試不完全殺死劑量(100ng/ml)的KCZ對白念珠菌RM1000的敏感性。結果發現，添加維生素C后，能夠顯著降低白念珠菌對酮康唑的敏感性。單獨添加維生素C或還原型谷胱甘肽后，白念珠菌細胞增殖活力明顯增強(圖2)。

圖2 維生素C對KCZ抑制白念珠菌RM1000的影響

3 討論

唑類藥物具有抗真菌譜廣、副作用小和口服吸收好等優點，在臨床上應用廣泛。酮康唑通過干擾細胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細胞膜主要固醇類-麥角固醇的生物合成，損傷真菌細胞膜并改變其通透性，以致重要的細胞內物質外漏，還可以抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和過氧化酶的活性，引起細胞內過氧化氫積聚導致細胞亞微結構變性和細胞壞死。谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸組成的短肽，在體內有氧化還原作用。它有兩種存在形式，即氧化型和還原型，還原型對保證細胞膜的完整性起重要作用。VC是一種強抗氧化劑，其本身被氧化，而使氧化型谷胱甘肽還原為還原型谷胱甘肽，從而發揮抗氧化作用[8]。為研究在畜禽感染白念珠菌疾病應用酮康唑治療的過程中，是否可以飼料添加或口服給與維生素C輔助治療來提高畜禽機體免疫力，通過體外添加維生素C的方法來測試白念珠菌菌株對酮康唑的敏感性，結果與前人的報道一致[7]，說明維生素C可能通過干擾過氧化氫的累積而影響著白念珠菌對酮康唑的敏感性，具體機制需要進一步研究。本研究結果為科學治療畜禽機會性真菌臨床感染提供了依據。

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[3] 杜光波, 徐莉, 高夢寧. 奶牛子宮內膜炎主要病原菌的調查[J]. 畜牧與獸醫, 2007,39(4): 24-26.

[4] 劉翠玲, 姜濤. 肉雞白色念珠菌病的診斷與防治[J]. 養殖技術顧問, 2011, 12: 122.

[5] 于立權, 楊小雪, 張紅紅等. 金黃色葡萄球菌胞外分泌物對白念珠菌ptc2缺失株酮康唑敏感性的影響[J]. 黑龍江八一農墾大學學報, 2013, 25(1): 37-40.

[6] 許友卿, 易波, 丁兆坤. 維生素E和維生素C的協同抗氧化作用及對水產動物的影響[J]. 飼料工業, 2011,32(14): 59-62.

[7] Yan Wang, Xin-Ming Jia, Jian-Hui Jia, Ming-Bang Li, Ying-Ying Cao, Ping-Hui Gao, Wan-Qing Liao, Yong-Bing Cao and Yuan-Ying Jiang. ASCORBIC ACID DECREASES THE ANTIFUNGAL EFFECT OF FLUCONAZOLE IN THE TREATMENT OF CANDIDIASIS[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2009, 36, e40-e46.

[8] 朱長林, 張文彬, 孫鵬等. 維生素C與維生素E的聯合免疫調節及抗氧化作用[J]. 中國臨床康復, 2006, 10(36):120-122.

（2014–02–20）

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