耐輻射奇異球菌R12海藻糖合成酶基因的克隆與表達

吳 茜，楊 鑫，朱麗英，張婧涵，徐 嫻，江 凌，

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京210009；2.南京工業大學食品與輕工學院，江蘇 南京210009；3.南京工業大學理學院，江蘇 南京210009）

耐輻射奇異球菌（Deinococcus wulumuqiensis）R12是一類極端微生物，它不僅對電離輻射、紫外輻射以及許多DNA損傷試劑具有抗性，還對干燥、過氧化物等具有較強的抗性。研究表明，耐輻射奇異球菌在環境脅迫下具有合成海藻糖的能力［1］。海藻糖是一種非還原性二糖，由2分子葡萄糖以1，1－糖苷鍵連接而成，其化學性質極穩定，無毒無害，不會焦糖化，是一種安全的天然多糖。海藻糖廣泛存在于低等植物、藻類、細菌、真菌、酵母、昆蟲及無脊椎動物中，既是一種貯存性糖類，又是應激代謝的重要產物。由于海藻糖具有保護生物細胞和生物活性物質在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環境下活性免遭破壞的功能，已被廣泛應用到醫藥、化妝品、食品加工、農業等領域［2－3］，受到研究者的廣泛關注，發展前景廣闊。

海藻糖有多種合成方法，如：天然生物提取法、化學合成法、微生物發酵法、基因工程法等，但都有一定弊端，而海藻糖合成酶以其一步催化的優點，成為近年來研究熱點［4－6］。其催化過程能耗低、底物麥芽糖來源廣且價格低，使得生產成本大大降低；此外，海藻糖合成酶特異性較強，只作用于麥芽糖轉化成海藻糖，工藝簡單，易于調控。因此，以麥芽糖為原料利用海藻糖合成酶生產海藻糖是一條極具工業化前景的途徑［7－8］。

1 實驗

1.1 材料與試劑

菌株Deinococcus wulumuqiensis R12、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3），自行保存；質粒PMD18Tvector、pET－22b（＋），TAKARA公司。

酵母粉、蛋白胨，英國OXOID公司；DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒，TAKARA公司；氨芐青霉素，南京生興生物有限公司；瓊脂糖，Promega分裝；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取［9］

取1～4mL野生型D.wulumuqiensis R12的過夜培養物，于12 000r·min－1離心2min，棄上清。細菌沉淀加入150μL的TE buffer（含RNaseA1），用槍吸打至充分懸浮細菌沉淀，提取總DNA。

1.2.2 基因克隆和重組表達載體構建

根據GenBank公布的序列設計引物，下劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點：

上游引物F：CGGGATCCGATGACGCAAGCA－CAAC

下游引物R：CAAGCTTGTTCAGCCGCAGCCAGT

PCR條件為：94℃預變性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1min；完成30個循環后72℃延伸5min。

PCR擴增產物用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片斷，與T載體連接，轉化E.coli DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆，送樣測序。

經測序無誤后小量提取質粒，用BamHⅠ和HindⅢ對質粒及表達載體pET－22b進行雙酶切，分別回收目的片段，連接后轉化E.coli DH5α，挑取陽性克隆提取質粒，轉化表達E.coli BL21（DE3）。

1.2.3 重組菌的誘導表達

挑取重組菌單菌落至LB氨芐液體培養基中，37℃振蕩過夜后，按1%的接種量轉接至新的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600值達0.6，加IPTG至終濃度為1mmol·L－1，誘導4h、6h、8h，等量取樣，10 000r·min－1離心2min，收集菌體。

1.2.4 表達產物的SDS－PAGE分析［10］

取發酵液2mL，離心，收集菌體，加PBS重懸，冰浴超聲破碎（工作4s，間隔2s，總5min）后，于10 000 r·min－1、4℃離心10min，取上清，加入2倍上清體積的緩沖溶液，沸水浴5min，取23μL點樣，進行SDS－PAGE分析。

1.2.5 重組酶的酶活測定

取發酵液2mL，離心，收集菌體，加PBS重懸，冰浴超聲破碎（工作4s，間隔2s，總5min）后，于10 000 r·min－1、4℃離心10min，取上清，即為粗酶液。取粗酶液100μL與等體積的質量分數為30%的麥芽糖溶液混合，靜置30min，沸水浴5min終止反應。

1.2.6 含量測定

離心收集反應液的上清，稀釋1 000倍進樣。使用Ultimate 3000型高效液相色譜儀進行含量測定。色譜柱為氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈－水（67∶33，體積比）；流速0.9mL·min－1；柱溫35℃；檢測器為示差折光檢測器；進樣量10μL。

2 結果與討論

2.1 海藻糖合成酶基因treS表達載體的構建

圖1 D.wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因treS的序列Fig.1 Gene sequence of treSin D.wulumuqiensis R12

應用Illumina HiSeq系統測定了D.wulumuqiensis R12的基因組草圖［11］，在GenBank中進行核酸序列的Blast檢索分析。結果發現，其核酸序列與已報道的D.wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因treS的核酸序列（圖1）有95%的同源性。

以D.wulumuqiensis R12總DNA為模板，F、R為引物進行PCR擴增，得到分子量約1 700bp的DNA片段，與目的基因大小相符。將擴增得到的DNA片段回收后與T載體連接，轉化E.coli DH5α，經測序無誤后小量提取質粒，用BamHⅠ和HindⅢ對質粒及表達載體pET－22b進行雙酶切，連接后轉化E.coli DH5α，菌落經PCR驗證為陽性克隆（圖2）。

2.2 表達產物的SDS－PAGE分析

圖2 重組菌菌落鑒定Fig.2 Identification of recombinant bacteria colony

重組菌經IPTG誘導表達后，離心收集菌體，用PBS緩沖溶液重懸菌體，在冰上經超聲破碎后，離心，分離上清和沉淀。用0.4μm濾膜過濾上清后，用Ni柱和His－tag的親和性進行分離和純化，將粗酶液和純化液進行SDS－PAGE分析，結果見圖3。

圖3 重組表達蛋白的SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis of recombinant expression proteins by SDS－PAGE

由圖3可看出，與圖3b中2、3泳道含空載體的表達宿主蛋白相比，圖3a中重組菌表達出大小約66 kDa的目的蛋白，經純化后，圖3a中7、9泳道純化蛋白達到分析純，可用于后續酶學性質研究。

2.3 重組酶性質的初步研究

以30%的麥芽糖為底物和重組酶進行麥芽糖轉化實驗，以確定最適反應溫度及pH值，然后利用HPLC分析反應物中海藻糖含量（占總糖的百分比），結果如圖4、5所示。

圖4 反應溫度對酶活的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on enzymatic activity

圖5 pH值對酶活的影響Fig.5 Effect of pH value on enzymatic activity

由圖4可看出，當反應溫度在25～35℃時，重組酶的活性隨反應溫度的升高而上升，當反應溫度超過35℃后，重組酶的活性逐漸下降。說明重組酶在35℃時轉化率最高。

由圖5可看出，當pH值在6.5～8.0時，重組酶的活性隨pH值的增大而上升，當pH值大于8.0后，重組酶的活性逐漸下降。說明重組酶在酸性至中性條件下轉化率較高，在pH值為8.0時轉化率最高。

以上結果表明：重組酶在35℃和pH值為8.0時活性最高，生成海藻糖最多，此時的轉化率約為67%。

3 結論

采用PCR法，以D.wulumuqiensis R12基因組DNA為模板，克隆出分子量約1 700bp的海藻糖合成酶基因treS，將其與T載體連接，并轉化E.coli DH5α獲得重組子，涂布劃線后進行菌落PCR擴增。然后經IPTG誘導表達得到約66kDa的目的蛋白。經酶活測定，誘導表達的重組海藻糖合成酶能將麥芽糖一步催化成海藻糖。以30%麥芽糖為底物進行海藻糖轉化實驗，結果顯示，該海藻糖合成酶在35℃、pH值為8.0時催化效率最高，轉化率達到67%。

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