硅基質膜吸附柱對質粒DNA再吸附能力的研究

劉傳青，向玲娟，黃 娟，陳孝平

（武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢430074）

隨著人們對質粒提取的濃度和純度的要求越來越高，傳統的質粒提取技術因費時長、提取效率低［1－2］亟待改進，硅基質膜吸附柱（離心柱型）質粒提取試劑盒的出現，正好解決了這一問題。硅基質吸附材料可特異性吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需用有毒溶劑如苯酚、氯仿等，使得提取基因組DNA像過濾一樣簡單，其原理為：在pH值等于或低于硅基質材料表面pKa值的高離子濃度緩沖溶液中，硅基質材料表面負電荷減少，DNA分子所帶負電荷與其表面的斥力減小，水合程度降低，被吸附到硅基質材料表面上［3－4］，與此同時，DNA分子與硅基質材料表面的羥基形成氫鍵，氫鍵力遠大于靜電斥力，DNA分子將牢牢吸附在硅基質材料表面［5－7］；再用pH值高于pKa值的低離子濃度的緩沖溶液洗脫吸附在硅基質材料表面的DNA分子，破壞其間的氫鍵，即可達到提取目的［8－9］。因此，硅基質膜材料吸附質粒已成為大規模分離純化DNA，去除蛋白、多糖、鹽類和有機溶劑等雜質的通用方法［10－11］。隨著生物學大通量實驗的出現，對商品化核酸提取試劑盒的需求量明顯增加，而且商品化的吸附柱大都是一次性的。根據硅基質膜材料作用原理推測通過某些溶液的處理，能恢復其吸附能力。作者在此探究了商品化質粒提取試劑盒中吸附柱重復利用的可能性，擬為降低分子生物學實驗成本提供參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

含pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1質粒大腸桿菌菌株，自行保存；質粒提取試劑盒，碧云天公司；PBS緩沖溶液、大批量質粒提取試劑，自行配制；1kb DNA ladder、XhoⅠ限制性內切酶，Takara公司。

臺式恒溫振蕩器，太倉實驗儀器廠；DYY－10C型電泳儀，北京六一儀器廠；HC－3018R型高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；暗箱式紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1質粒水溶液的制備

挑取含pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1質粒單菌落至50mL含氨芐抗生素的LB培養基中，37℃、180 r·min－1下振蕩培養12～16h。用大批量質粒提取試劑提取質粒，用水保存質粒。

1.2.2 吸附柱的處理

1）不同溶液

取3支吸附柱各加200μL質粒水溶液過柱，用100μL洗脫液反復洗脫3次盡可能除去吸附柱上吸附的質粒。將第1次過柱回收的質粒于－20℃保存。將吸附柱分別置于離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為7.01的PBS緩沖溶液、75%酒精溶液和雙蒸水中，于4℃保存3d和6d后取出，重新加入200μL質粒水溶液，用100μL洗脫液洗脫，回收的質粒與第1次過柱回收質粒一起用XhoⅠ單酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同溶液的處理效果。

2）pH值

配制不同pH值的PBS緩沖溶液（表1）。將質粒水溶液第1次過柱后回收的質粒于－20℃保存。將吸附柱編號對應放入編號燒杯中，于4℃保存6d后取出，重新加質粒水溶液再次過柱，回收的質粒與第1次過柱回收質粒一起用XhoⅠ單酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同pH值時的處理效果。

表1 不同pH值的PBS緩沖溶液Tab.1 PBS Buffers with different pH values

3）離子濃度

配制不同離子濃度的PBS緩沖溶液（表2）。將質粒水溶液第1次過柱后回收的質粒于－20℃保存。將吸附柱編號對應放入編號燒杯中，于4℃保存6d后取出吸附柱，重新加質粒水溶液再次過柱，回收的質粒與第1次過柱回收質粒一起用XhoⅠ單酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同離子濃度下的處理效果。

表2 不同離子濃度的PBS緩沖溶液Tab.2 PBS Buffers with different ion concentrations

4）溫度

將質粒水溶液第1次過柱后回收的質粒于－20℃保存。將吸附柱放入離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為2.04的PBS緩沖溶液中，分別于常溫、4℃和－20℃保存6d后取出，重新加質粒水溶液再次過柱，回收的質粒與第1次過柱回收質粒一起用XhoⅠ單酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同溫度下的處理效果。

2 結果與討論

2.1 不同溶液處理效果

由于質粒存在多種形式，電泳時無法集中在同一條帶進行分析，為了更好地比較質?；厥盏男?，將經過不同溶液處理的吸附柱所回收的質粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內切酶進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1所示。

圖1 不同溶液處理效果Fig.1 The effects treated by different solutions

從圖1可以看出：水處理在短期內（3d）可以恢復吸附柱一定的再吸附能力，隨著時間的延長吸附柱的再吸附能力越來越弱；0.01mol·L－1PBS緩沖溶液和75%酒精溶液處理都可以恢復吸附柱一定的再吸附能力，并且0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理的吸附柱的再吸附能力要強于75%酒精溶液處理的，且其再吸附能力比吸附柱第1次吸附能力有所增強。用0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理吸附柱6d，吸附柱再吸附能力恢復效果最好。故選用0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理吸附柱。

2.2 pH值對吸附柱吸附能力的影響

將不同pH值的0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理的吸附柱回收的質粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內切酶進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖2所示。

圖2 pH值對吸附柱吸附能力的影響Fig.2 The effect of pH value on adsorbability of adsorption column

從圖2可以看出：pH值對吸附柱再吸附能力影響很大；低pH值有利于吸附柱恢復再吸附能力。這是因為，經過低pH值溶液處理的吸附柱硅基質膜表面負電荷減少，DNA分子帶有的負電荷與硅基質膜之間的斥力減小，有利于吸附柱吸附DNA分子［6］。實驗組吸附柱經pH值2.04的PBS緩沖溶液處理后，對DNA分子表現出較好的吸附效果，表明其恢復了較高的再吸附能力。故選用pH＝2.04的PBS緩沖溶液處理吸附柱。

2.3 離子濃度對吸附柱吸附能力的影響

將不同離子濃度、pH值為2.04的PBS緩沖溶液處理的吸附柱回收的質粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內切酶進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖3所示。

圖3 離子濃度對吸附柱吸附能力的影響Fig.3 The effect of ion concentration on adsorbability of adsorption column

從圖3可以看出：離子濃度對吸附柱的再吸附能力影響不明顯；較高的離子濃度反而對吸附柱的再吸附能力有抑制作用。實驗組只用了不同離子濃度的溶液處理吸附柱，還應該增加對DNA分子樣品離子濃度的考察。因為高離子濃度的DNA分子樣品可以有效地降低DNA分子的水合度從而更好地驅使DNA分子與吸附柱硅基質膜的結合［6］。用離子濃度為0.01mol·L－1的PBS緩沖溶液處理吸附柱，可以使其恢復較高的再吸附能力。故選用離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為2.04的PBS緩沖溶液處理吸附柱。

2.4 溫度對吸附柱吸附能力的影響

將經過不同溫度處理的吸附柱回收的質粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內切酶進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖4所示。

圖4 溫度對吸附柱吸附能力的影響Fig.4 The effect of temperature on adsorbability of adsorption column

從圖4可以看出：較低的溫度有利于吸附柱再吸附能力的恢復，最佳溫度為4℃。

2.5 討論

實驗中發現，經過處理的吸附柱的再吸附能力相對于吸附柱第1次吸附能力有所增強，可能是吸附柱在較低溫度的低鹽高pH值的溶液中保存要比在空氣中保存更有利于提高其吸附能力，這為提高商品化質粒提取試劑盒回收質粒的濃度提供了一定的理論基礎。

3 結論

為了更好地降低生物學實驗成本，對市場上質粒提取試劑盒中吸附柱可重復利用性進行了初步研究。探討了不同溶液、保存時間、pH值、離子濃度以及溫度對恢復吸附柱再吸附能力的影響。結果表明：使用后的吸附柱經過一定的處理可以有效地恢復其對質粒DNA的再吸附能力。確定最佳處理條件為：在離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為2.04的PBS緩沖溶液中于4℃保存6d。經過處理，吸附柱的再吸附能力相對于其第1次吸附能力有所增強。

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