響應面法優化及制備丹參酮ⅡA 白蛋白納米粒

劉麗薇， 承 偉

(遼寧醫學院藥學院，遼寧 錦州121000)

丹參酮是從唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge 根中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，其中丹參酮ⅡA是丹參中脂溶性成分的代表［1］。丹參酮ⅡA具有保護大腦、治療心血管方面疾病、抑制肝細胞損傷、抗感染和抑制成纖維化神經元細胞增殖等多方面的藥理作用。尤其近些年研究者越來越關注其在抗腫瘤方面的作用，并在臨床上用于治療肝腫瘤、胃腫瘤、白血病等疾病，顯示出較好療效［2-5］。研究表明通過聯合使用丹參酮ⅡA，可使細胞停止生長，阻滯于G0/G1期，阻止細胞進入s 期、DNA 合成期，從而有效控制了癌細胞的生長繁殖［6］。丹參酮ⅡA作用于ERK 通路上抑制其活化程度，從而延緩卵巢癌細胞增殖，并使大量細胞被誘導凋亡，其主要作用機理是使降低bcl-2 表達，使Bax 表達上調［7］。由于丹參酮ⅡA為脂溶性小分子藥物，口服生物利用度較低，在體內代謝和排泄較快［8］，故臨床上多采用丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液，但該制劑在臨床應用時穩定性較差，刺激性較強，病人耐受性差［9］。本實驗主要針對丹參酮ⅡA的化學性質，擬應用納米生物給藥系統，以提高丹參酮ⅡA的生物利用度以及延長其在體內的滯留時間，提高其抗腫瘤效果。作者采用牛血清白蛋白作為載體材料，白蛋白分子中的氨基酸通過肽鍵相互接接，形成大量的網狀孔隙，并且互相扭曲形成團狀，藥物可鑲嵌在其中，便于攜帶。同時具有可生物降解和低免疫原性的特點。采用去溶劑化交聯法制備丹參酮ⅡA白蛋白納米粒，響應面法優化納米粒處方工藝，并對其體外釋放特性進行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2450 紫外可見分光光度計(日本島津公司);RC-6 溶出度測試儀(天津市新天光儀器分析技術有限公司);JEM-1200EX 透射電子顯微鏡(日本電子公司);KQ-300E 型超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司);透析袋(MV:1000-3000，美國spectrum 公司);Nano ZS90納米粒度和Zeta 電位及分子量分析儀(英國Malvern 公司);

1.2 試藥 牛血清白蛋白(BSA) (FractionV SIGMA 公司);丹參酮ⅡA對照品(中國食品藥品檢定研究院，編號110766-200918，純度＞98%);丹參酮ⅡA(批號20090723，陜西昂盛生物醫藥科技有限公司，質量分數＞95%);其余試劑(分析純，市售)。

2 方法與結果

2.1 丹參酮ⅡABSA 納米粒的制備［10］通過去溶劑化交聯法，取適量BSA 溶解于去離子水中，震蕩、渦旋至全部溶解，取適量乙醇加入丹參酮ⅡA使之充分溶解。在一定轉速攪拌下緩緩滴加含有藥物的無水乙醇，注意控制滴速，至出現乳光后，滴加0.2%戊二醛，繼續渦旋至混勻，旋轉蒸發至除去乙醇，得到出現明顯乳光的溶液體系，即得丹參酮ⅡABSA 納米粒，繼續攪拌一定時間，即得。最后經過冷凍干燥得到納米粒。

2.2 檢測波長的確立及繪制標準曲線

2.2.1 檢測波長的選擇 精密稱取丹參酮ⅡA對照品適量，加乙醇定容至50 mL，配成對照品溶液。分別將對照品和輔料水溶液稀釋至一定濃度后，以乙醇為空白對照，在波長260 ～600 nm 掃描，丹參酮ⅡA在270 nm 處有最大吸收，而除丹參酮ⅡA外的其他輔料在此波長下則不吸收。故選定270 nm 作為測定波長。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密吸取對照品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、5.0 mL 加乙醇定容至50 mL。以270 nm 吸光度(A)對丹參酮ⅡA的質量濃度(C)作標準曲線，進行標準曲線繪制，得到的標準回歸方程A =0.012 6C+0.169 (n=6)，r =0.999 9，表明丹參酮ⅡA在3.06 ～30.6 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3 測定納米粒包封率 精密稱取適量丹參酮ⅡABSA 納米粒分散于10 mL 乙醇溶液中，在20 000 r/min 下冷凍離心30 min，根據回歸方程計算上清液中的丹參酮ⅡA的量。即得到未被納米粒包封的游離藥物含有量，根據以下公式計算納米粒包封率:

2.4 響應面分析方案及試驗結果

2.4.1 模型建立與方差分析 在前期大量預試驗的基礎上，最終選定藥物量與BSA 比例 (A)、乙醇與水比例(B)、乙醇滴速(C)3 因素作為考察對象，利用Design-Expert 軟件，以藥物包封率(EE%)為響應指標進行實驗考察。根據Box-Benhnken 試驗設計原理設計實驗［11-12］，響應面分析方案見表1。回歸方程各項的方差分析見表2。由Box-Benhnken 設計擬合，得響應值(Y)對編碼自變量的二次多項回歸方程為Y = +81.12 -3.96A -4.41B +2.43C -1.75AB+2.52AC+2.53BC- 8.14A2+1.01B2-4.21C2。對上述回歸模型進行方差分析，回歸模型的F 值為58.01，概率P ＜0.000 1，表明模型極顯著。失擬項為0.65，沒有顯著性差異;其r2值為0.963 5，表明96.35% 響應值變化可以用此模型解釋，這表明該模型相關性良好。從回歸模型方差分析結果上看，該模型的擬合度較好。各因素的一次項存在極顯著性，二次項A2、C2也表現出極顯著性。

2.4.2 模型優化與預測 由回歸方程經處理得到的藥物量與BSA 比例、乙醇與水比例、乙醇滴速的交互作用對藥物包封率影響的響應面。回歸模型預測的最佳處方工藝為藥物量與BSA 比例為0.09 (g/g)，乙醇與水比例為0.53(g/g)、乙醇滴速為1.27 mL/min，模型預測包封率為84.35%。

表1 響應面設計和包封率

表2 響應面法方差分析

2.4.3 驗證試驗 為驗證響應面法的可靠性，采用上述最優條件進行丹參酮ⅡABSA 納米粒制備，測定藥物包封率重復3 次，結果見表3。獲得的包封率分別為85.79%、87.43%、84.12%，平均包封率為85.78%，結果與預測值84.35%比較接近，所以，工藝條件采用響應面法進行篩選，數據準確可靠，具有一定的實際應用價值。模型預測值和實驗觀察值都比較接近，模型具有良好的預測性。

表3 響應面法驗證試驗結果

2.5 丹參酮ⅡABSA 納米粒的形態學及粒徑分析 通過透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態和大小，在覆有支持膜的銅網上滴加丹參酮ⅡABSA 納米粒溶液2 ～3 滴，干燥10 min，觀察。見圖1。從圖1 可以看出，丹參酮ⅡABSA 納米粒為球形或類球形，分散度和球形度良好，大小相對均一。

2.6 釋放率測定 分別精密稱取冷凍丹參酮ⅡABSA 納米粒和丹參酮ⅡA原料藥適量，置于透析袋中，扎緊袋口，懸浮于加有50 mL 磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的具塞錐形瓶中，以100 r/min 的振蕩頻率于37 ℃下水浴振搖，在不同時間點(0.5、1、2、4、6、9、12、18、24 h)取透析液5 mL，照“2.3”項下進行含量分析，計算出各時間點的藥物濃度和累積釋放率，同時補加介質5 mL。取3 份樣品平行實驗，所得結果繪制累積釋放率-時間曲線，比較丹參酮ⅡABSA 納米粒與原料藥體外釋放行為。由圖2 可以看出，納米粒比原料藥具有明顯的緩釋作用;原料藥在4 h 內累計釋放率為95.1%，基本釋放完全。納米粒的體外釋放體現出兩相釋放形式，前4 h 藥物累積釋放率為(46.5 ±3.7)%，屬于快速釋放。4 h 后釋藥由藥物擴散導致，24 h 累積釋放率為(97.3 ±6.6)%，為緩慢低速釋放。對最佳工藝條件制備的丹參酮ⅡABSA 納米粒按不同釋藥模型擬合，由表4可看出，通過相關系數判斷擬合程度，丹參酮ⅡABSA 納米粒體外釋放特征用一級方程擬合最佳。表明藥物釋放主要通過Fick 擴散完成。

圖2 丹參酮ⅡA BSA 納米粒和丹參酮ⅡA 原料藥的體外釋放曲線(n=3)

表4 丹參酮ⅡA BSA 納米粒體外釋藥模型擬合

3 討論

其他文獻報道制備丹參酮ⅡA納米粒所用的制備方法如乳化交聯法、乳化溶劑揮發法，反應劇烈，并且需要采用大量有機溶劑［13-14］，藥物包封率低［15］。本實驗通過使用去溶劑化交聯法制備丹參酮ⅡABSA 納米粒，采用乙醇破壞BSA 周圍形成的水化膜而使其沉淀出來，形成納米粒。得到的納米粒粒徑均一，分散度好，藥物的包封率高，納米粒具有明顯的緩釋效應。本法制備工藝簡單易行，反應溫和，不需要使用有毒的有機溶劑，不存在溶劑殘留問題。得到的分散體系通過加入戊二醛進行交聯，提高納米粒的分散度和穩定性。選用牛血清白蛋白(BSA)作為載體材料，生物相容性好，無免疫原性，BSA 已成為一種非常成熟的藥物傳遞系統載體材料，常被作為藥物及反義寡核苷酸的載體。

根據文獻報道和已完成初步試驗結果，筆者將其他條件固定，主要考察了藥物量與BSA 比例、乙醇與水比例、乙醇滴速這3 個因素對納米粒包封率的影響，以納米粒的制劑學有關參數為指標，運用響應面法篩選出了丹參酮ⅡABSA 納米粒合理的工藝條件，驗證試驗表明，處方工藝合理，穩定可行。

納米粒體外釋放呈現出一級釋放特征，說明藥物從納米粒釋放主要受Fick 擴散影響。初始階段，吸附在納米粒表面的藥物與溶出液接觸，進入溶出介質，造成藥物快速釋放。隨著外液逐步擴散到其內部，再攜帶著丹參酮ⅡA從內部向外擴散;從整個釋放過程可以看出，BSA 納米粒能夠使藥物長時間維持在穩態濃度，能夠起到控制藥物緩慢釋放作用，使其更好地發揮治療效率。

［1］ 蔡麗萍，習志剛，楊 紅. 丹參酮的藥理作用和臨床研究進展［J］. 廣東藥學院學報，2008，24(3):321-324.

［2］ 張民慶，龔惠明. 抗腫瘤中藥的臨床應用［M］. 北京:人民衛生出版社，1998:256-258.

［3］ 王 旭，頡玉欣，單保恩. TanⅡA 對人胃腫瘤BGC-823 細胞增殖及凋亡的影響［J］. 腫瘤防治，2008，20(1):56-59.

［4］ 馮玉光，邢國輝，宗緒山，等. TanⅡA 聯合5-Fu 對人胃癌SGC7901 細胞增殖和凋亡與突變型p53 蛋白表達的研究［J］. 中華腫瘤防治雜志，2010，17(11):831-834.

［5］ 邢國輝，馮玉光，宗緒山，等. TanⅡA 聯合5-Fu 對低氧下人胃癌SGC7901 細胞增殖、凋亡的影響及與HIF-1α 和突變型P53 表達的關系［J］. 世界華人消化雜志，2010，18(3):222-228.

［6］ 王修杰，袁淑蘭，黃韌敏，等. Brdu 和PCNA 標記觀察丹參酮對癌細胞增殖的影響［J］. 華西醫科大學學報，1996，27(4):390.

［7］ 劉 偉，陳 吳. 丹參酮ⅡA對人卵巢癌細胞株CAOV-3增殖與凋亡的影響［J］. 醫藥導報，2007，26 (12):1398-1400.

［8］ 陳新謙，金有豫. 新編臨床藥物學［M］北京:人民衛生出版社，1998:101-105.

［9］ 錢名堃，楊保津，顧文華，等. 丹參有效成分的研究-I.TanⅡA 磺酸鈉和次甲丹參醌的化學結構［J］. 化學學報，1978，36(3):199-206.

［10］ 張良珂，侯世祥，宋相容，等. 一種白蛋白納米粒的制備與評價［J］. 中國藥學雜志2007，42(5):365-367.

［11］ 李春英，李曉娟，楊 磊，等. 響應面分析法優化甘草酸和甘草黃酮聯合提取工藝［J］. 黑龍江大學自然科學學報，2009，26(3):390-395.

［12］ 孫麗君，林長春，趙翔宇，等. 響應面設計優化超臨界CO2抗溶劑法制備負載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒［J］. 食品科學，2011，32(8):19-23.

［13］ 甘良春，侯世祥，畢岳琦，等. 星點設計-效應面法優化丹參酮ⅡA納米粒的制備工藝［J］. 中國藥學雜志，2007，42(10):758-761.

［14］ 李 琦，王 炎，范忠澤，等. 丹參酮ⅡA及其納米粒誘導肝癌細胞凋亡及對p38MAPK，TGFβ1 信號蛋白表達的影響［J］. 腫瘤，2008，28(1):8-12.

［15］ 安 蕓，苗 方，尹祥敏，等. 丹參酮ⅡA固體脂質納米粒的制備［J］. 醫學理論與實踐，2009，22(7):869-870.