響應面法優化倒卵葉五加多糖鐵 (Ⅲ)合成工藝條件研究

趙 鵬， 張婷婷， 張麗華， 宋 逍

(陜西中醫學院藥學院，陜西 咸陽712046)

缺鐵性貧血(iron deficiency anaemia，IDA)是一種常見的營養性疾病。目前，臨床上用于治療IDA 的藥物主要是硫酸亞鐵制劑，其存在生物利用度低和較大的胃腸刺激性等缺點［1］。因此急需開發出一種含鐵量高、溶解性好及副作用小的新型補鐵劑來滿足臨床治療IDA 的需要。

近年來，以三價鐵為核心，生物活性多糖為配體的多糖鐵絡合物正成為研制新型補鐵劑研究熱點，研究者們開發出了一系列不同多糖配體的多糖鐵類絡合物［2-6］，而以力蜚能為代表的多糖鐵復合物制劑則早已進入臨床應用階段［7］。相較于傳統補鐵劑，多糖鐵絡合物具有副作用小、配合性穩定、溶解度好，含鐵量高等優點，對治療缺鐵性貧血具有較好的療效，此外，作為配體的多糖一般都具有提高免疫、抗氧化性等多方面的生物活性，在補鐵的同時，還可進一步提高機體免疫力，因此其是一種比較理想的補鐵劑［8］。

倒卵葉五加Acanthopanax obovatus Hoo 屬五加科五加屬植物，分布于陜西、寧夏、甘肅等地［9］。倒卵葉五加多糖是其主要的活性成分之一，具有明顯的調節機體免疫、抗氧化性等生物活性［10-11］。鑒于此，本研究以陜西產倒卵葉五加為原料，從中提取倒卵葉五加多糖，與鐵(Ⅲ)進行絡合反應，研究制備倒卵葉五加多糖鐵(Ⅲ)絡合物(縮寫為AHC，下同)的合成工藝路線，利用響應面法優化了其合成工藝條件，并對AHC 的理化性質進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 倒卵葉五加購自陜西省西安萬壽路中藥材批發市場(經陜西中醫學院宋逍副教授鑒定為倒卵葉五加Acanthopanax obovatus Hoo 的干燥根、莖);檸檬酸三鈉、三氯化鐵、無水乙醇、三氯甲烷、石油醚(60 ～90 ℃)、氫氧化鈉、鄰菲啰啉、Vc、K4［Fe(CN)6］ 等試劑均為分析純。

UV-2501PC 紫外可見分光光度儀(日本島津公司);FA2004 電子天平(上海精科天平廠);4K15 臺式離心機(Sigma 公司);ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(德國Christ公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 倒卵葉五加多糖的制備 將倒卵葉五加的根莖在80 ℃下干燥，粉碎后過60 目篩。再將其用石油醚在回流下脫脂2 次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1 ∶15 (g/mL)80 ℃下提取2 次，提取液合并，再按1 g 生藥材濃縮為1 mL 進行濃縮，濃縮液經脫蛋白、脫色處理后，用4 倍體積量的無水乙醇醇沉，即得倒卵葉五加粗多糖，將其用截留分子質量為3 500 透析袋流動水透析48 h，透析液濃縮，再醇沉，即得制備倒卵葉五加多糖鐵的原料，此時多糖的含有量為84.9%。

1.2.2 AHC 的合成 稱取一定量的倒卵葉五加多糖和檸檬酸三鈉，溶于雙蒸水中，水浴加熱至一定溫度，此時，逐滴交替加入2 mol/L FeCl3溶液和20%NaOH 溶液，控制溶液的pH 在合適的范圍內。當上述反應液中生成不溶性的沉淀時，即停止加入FeCl3和NaOH，繼續反應1 h 后冷卻。將反應液過濾，除去沉淀，濾液用4 倍量的無水乙醇沉靜至過夜后過濾，將濾餅用無水乙醇和乙醚洗滌后，真空干燥，即得AHC，具體工藝路線如圖1 所示。

1.2.3 AHC 制備工藝條件優化 本研究按照Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎之上，以倒卵葉五加多糖鐵中鐵的含有量作為響應值，采用反應溫度、配料比(多糖與檸檬酸三鈉的質量比)和pH 等三個對倒卵葉五加多糖鐵中含鐵量影響較大的因素進行響應面優化實驗，實驗因素和水平設計如表1 所示。

圖1 倒卵葉五加多糖鐵(Ⅲ)絡合物制備工藝流程

表1 實驗因素水平

1.2.4 AHC 中含鐵量測定 參照文獻［2］，采用鄰菲羅啉分光光度法測定AHC 中鐵的含有量。

1.2.5 AHC 的還原性試驗 參照文獻［2］，采用鄰菲羅啉比色法對AHC 進行還原性試驗。

2 結果與討論

2.1 AHC 合成工藝

2.1.1 響應面優化分析 本研究依據單因素實驗結論，以AHC 的含鐵量為指標，應用響應面設計法優化AHC 的合成工藝，響應面分析結果見表2 ～3。

表2 響應面分析實驗方案及實驗結果

采用Design-Expert 7.01 軟件對響應面優化試驗得到的結果進行研究，研究結果見表2，按照各因素對試驗結果的影響進行二次方程擬合，擬合得到下式:

表3 方差分析

根據表3 中所得到的分析結果能夠發現，回歸方程的F 值為109.32，其顯著水平遠遠低于0.05，這說明，利用響應面法擬合得到的試驗模型顯著性極高，利用擬合模型回歸得到的二次方程，分析其因變量和自變量之間的線性相關系數后可以看到，r =286.04/288.08 =0.992 9，這一點說明用該數學模型來評估各相關因素對AHC 中含鐵量的影響真實可靠。從表3 的方差分析結果可以看出，響應面試驗組合的各單因素中，對AHC 中含鐵量影響最大的是配料比，其次是反應溫度，pH 的影響最小，為不顯著影響因素。

對回歸方程 (1)求一階偏導［12］，可得出:X1=-0.49，X2=0.87，X3=0.18;由此可得到按照回歸模型預測合成AHC 的最優工藝條件是:反應溫度為75.1 ℃，配料比為3.87，pH 值為8.09，在此工藝條件下，預測得到的AHC 中含鐵量為19.45%。

2.1.2 驗證試驗 根據預測的實驗結果，并從實際工藝操作方便考慮，微調AHC 合成的最佳工藝條件為:溫度為75 ℃，配料比為3.9，pH 為8.0，在此工藝條件下重復操作3 次，得到的AHC 中含鐵量的平均值為19.43%，這說明通過回歸方程預測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。

2.2 AHC 的理化性質

2.2.1 AHC 的一般理化性質 AHC 的外觀呈紅棕色，是無定形粉末，熔點較高(＞300 ℃)，難溶于常見的有機溶劑，易溶于水，得到的溶液為中性。將K4［Fe(CN)6］ 溶液滴入AHC 的水溶液中，結果未發生Fe (Ⅲ)離子的顯色反應，這說明AHC 是以絡合物的形式存在于水溶液，沒有游離的Fe3+存在。當調節AHC 的水溶液的pH 4 ～12 范圍內變動時，發現無沉降、水解現象出現，這說明AHC 具有較好的穩定性。

2.2.2 AHC 的還原性試驗 稱取0.005 g 的AHC，溶于一定量的雙蒸水中，加入10%的Vc 水溶液5 mL 和0.12%的鄰菲羅啉溶液5 mL，NaAc 溶液5 mL，用50 mL 的量瓶定容后，在恒溫37 ℃下不斷攪拌，在不同的時間點取樣，以不加入AHC 的溶液做空白，510 nm 波長處測定吸光度(A)。結果見圖2。

圖2 AHC 與Vc 反應體系的A-t 曲 線

由圖2 可知，AHC 在3 h 內基本能被Vc 逐漸還原成Fe(Ⅱ)，可見AHC 具有良好的溶出被還原性能，這說明AHC 作為口服補鐵劑時，可被還原性物質將其中的Fe(Ⅲ)還原為Fe (Ⅱ)，從而被機體所吸收，具有較好的生物利用度。

3 結論

3.1 本研究利用檸檬酸三鈉-三氯化鐵法得到了AHC，并通過響應面法確定了合成的最優工藝條件為:溫度為75 ℃，配料比為3.9，pH 為8.0，在此工藝條件下重復操作3 次，得到的AHC 中含鐵量的平均值為19.43%。

3.2 通過對AHC 的理化性質和還原性試驗可知AHC 的水溶液中不含游離的Fe3+，這說明其具有較小的胃腸道刺激的副作用，而且其在3 h 內基本能被Vc 還原為Fe (II)，具有較好的生物利用度。

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