氧化苦參堿抑制異丙腎上腺素誘導心衰大鼠心肌肥厚及對血清ET-1 及NO 的影響

徐清斌， 袁婭妮， 王 洋， 劉俊梅， 買淑霞， 熊愛琴， 馬 萍， 鄭 萍，戴貴東

(1. 寧夏醫科大學總醫院，寧夏銀川750004;2. 寧夏醫科大學藥學院，寧夏銀川750004;3. 銀川市口腔醫院藥劑科，寧夏銀川750001;4. 凱里學院化學與材料工程學院，貴州凱里556011)

氧化苦參堿(oxymatrine)別名苦參素，是寧夏特色回藥材苦豆子Sophora alopecuroides L. 中提取的一種喹諾哩西啶類結構生物堿［1］。具有抗心律失常、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理作用［1］。其對心血管也具顯著作用［1-2］，氧化苦參堿可對冠脈結扎所致大鼠急性心肌梗死具有保護作用，逆轉心肌重構［3］。心肌肥厚是心臟對增加的工作負荷的一種適應性反應，是慢性心力衰竭的重要病理特征。研究表明，心力衰竭時心血管系統內皮功能障礙導致內皮素(ET-1)與一氧化氮(NO)平衡失調，ET-1 增加可使血管分布的組織血流明顯減少，持續高水平的ET-1可導致心肌肥厚、心室重構［4-5］;而心力衰竭時內皮型一氧化氮合酶(eNOS)減少可使內源性NO 合成減少，內皮細胞依賴的舒血管作用減弱，加重心力衰竭［6-7］。本實驗重點探討氧化苦參堿是否是通過恢復血清ET-1 和NO 水平，調節心肌組織NO 水平和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達，從而抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌肥厚，進一步闡述氧化苦參堿抑制慢性心力衰竭的機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗試劑 氧化苦參堿(寧夏紫荊花藥業有限公司提供，批號20091028);異丙腎上腺素(ISO) (上海梯西愛有限公司提供，批號MVSTF-NF);內皮素(ET-1)酶聯免疫反應檢測試劑盒(武漢華美試劑有限公司提供);組織一氧化氮(NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所提供);全蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司提供);兔抗山羊eNOS 一抗(Abcam 公司提供);小鼠抗β-actin 抗體、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術公司提供)［8］。

1.2 主要儀器 H1850R 型臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);TY96-ⅡN 型超生細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Mutiskan Go 多功能酶標儀(美國賽默飛世爾儀器公司);蛋白凝膠電泳儀(美國伯樂公司);凝膠成像系統(上海培清科技有限公司，型號培清JS-860B)［8］。

1.3 動物 健康雄性SD 大鼠，體質量(230 ±20)g，合格證為SCXK (寧)2012-0001，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供［8］。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥 大鼠40 只，隨機分成5 組，分別為正常對照組、單用氧化苦參堿100 mg/kg 組、異丙腎上腺素模型組(ISO)、氧化苦參堿100 mg/kg 組和氧化苦參堿50 mg/kg 組。根據文獻［8-10］，ISO 模型組和氧化苦參堿各組，皮下多點給予5 mg/(kg·d)ISO，連續7 d，正常對照組及單用氧化苦參堿組皮下給予等體積生理鹽水，且皮下注射ISO 均在灌胃給藥1 h 前進行，單用氧化苦參堿組和氧化苦參堿各組于ISO 注射前，提前7 d 灌胃氧化苦參堿，共計14 d，正常對照組和ISO 組給予相應體積生理鹽水灌胃［8］。

2.2 心肌肥厚指數的檢測 各組動物在取血后立即處死，開胸取心臟，于4 ℃生理鹽水清洗，剝離整個心臟，數字分析天平稱取全心質量(HW，Heart weight);沿冠狀溝方向分離并稱重左心室質量(LVW，left ventricular weight)。計算全心質量/體質量(HW/BW，mg/g)及左心室質量/體質量(LVW/BW，mg/g)比值。

2.3 心肌組織病理觀察和統計 切取部分心尖，10%中性甲醛固定后逐級乙醇脫水，常規石蠟包埋，取4 μm 厚切片，行HE 染色，100 倍光鏡下觀察。將心肌病理損傷分為4 等級，分別為未見異常(-)、輕度損傷(+)、中度損傷(+ +)和重度損傷(+ + +)［8，11］。記錄心肌病理損傷不同等級大鼠的只數。

2.4 血清中ET-1、NO 水平及心肌組織中NO 測定 從-70 ℃冰箱取待測血清，按照ELISA 試劑盒廠家說明書操作，檢測ET-1 和NO 水平。從-70 ℃冰箱取待測心肌組織100 mg，經液氮研磨，加入0.89% 生理鹽水超聲勻漿，4 ℃離心機2 500 r/min 離心15 min 取上清，嚴格按廠家說明檢測心肌組織NO 的水平。

2.5 Western blot 分析心肌組織eNOS 的表達 提取心肌組織蛋白并定量為6.25 μg/mL，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液使終質量濃度調至5 μg/mL，煮沸10 min，3 000 r/min 離心1 min 混勻。取變性后的蛋白60 μg 在7.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離(SDS-PAGE)。電泳后采用濕法轉膜，將條帶轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉液室溫下孵育1 h 后分別用一抗(eNOS，1 ∶300 稀釋)和β-actin (1 ∶1 000 稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS-T 洗膜3 次后分別加入二抗山羊抗兔(1 ∶3 000)和兔抗小鼠(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，PBS-T 洗膜4 次后，取出硝酸纖維素膜加入化學發光劑顯色，曝光膠片，條帶以目的蛋白與相關β-actin 光密度比表示，結果采用培清JS-860B 凝膠成像系統半定量分析。

2.6 數據處理 采用SPSS 11.5 軟件，計量資料組間比較采用One-way ANOVA 分析。等級資料采用秩和檢驗［編秩，確定秩次范圍，計算平均秩次(mean rank)］。數據以±s 表示，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠心肌肥厚指數 與正常對照組比較，單用氧化苦參堿組大鼠HW/BW 和LVW/BW 無顯著性差異。ISO組大鼠HW/BW 和LVW/BW 與正常對照組相比顯著增大(P ＜0.01)，氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)組HW/BW和LVW/BW 均下降(P ＜0.01)。提示氧化苦參堿可改善ISO 致大鼠的心肌肥厚。結果見表1。

表1 氧化苦參堿對ISO 致心力衰竭大鼠HW/BW 和LVW/BW 的影響(±s，n=8)

表1 氧化苦參堿對ISO 致心力衰竭大鼠HW/BW 和LVW/BW 的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組比，＊＊P ＜0.01;與ISO 模型組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)初始體質量/g終末體質量(BW)/g全心質量(HW)/g左心室質量(LVW)/g HW/BW/(mg·g -1)LVW/BW/(mg·g -1)正常對照單用氧化苦參堿—230.1 ±12.6 231.1 ±12.3 314.6 ±30.7 322.9 ±32.3 1.04 ±0.08 1.06 ±0.08 0.69 ±0.05 0.72 ±0.07 3.31 ±0.22 3.31 ±0.31 2.22 ±0.21 2.24 ±0.21 ISO 5 230.6 ±10.4 287.8 ±23.4 ＊＊ 1.49 ±0.10 ＊＊ 1.00 ±0.06 ＊＊ 5.08 ±0.15 ＊＊ 3.41 ±0.19 ＊＊ISO+氧化苦參堿 100 236.1 ±10.6 291.8 ±15.9 1.38 ±0.09 # 0.93 ±0.06 # 4.71 ±0.14 ## 3.19 ±0.16 ##50 232.8 ±13.3 300.5 ±13.9 1.39 ±0.07 # 0.96 ±0.07 4.78 ±0.24 ## 3.15 ±0.19 100##

3.2 各組大鼠心肌組織病理的改變 光鏡下觀察HE 染色結果顯示，正常對照組和單用氧化苦參堿組大鼠心肌纖維排列整齊，細胞核染色清晰;ISO 組心肌纖維紊亂，纖維化嚴重，少量炎細胞浸潤，僅見少量正常心肌細胞;氧化苦參堿干預組病理改變優于ISO 組，介于正常對照組和ISO組之間，尤以氧化苦參堿(100 mg/kg)組改善情況最為明顯。統計分析結果表明，與正常對照組相比較，單用氧化苦參堿組秩次無顯著差異(P ＞0.05)，而與ISO 組秩次存在顯著性差異(P ＜0.01);氧化苦參堿各組與ISO 組比較秩次均存在顯著性差異(P ＜0.05)。說明氧化苦參堿能減輕ISO 致心衰大鼠的心肌損傷［8］。結果見表2 和圖1。

表2 各組大鼠心肌組織病理分級的影響(±s，n=8)

表2 各組大鼠心肌組織病理分級的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組相比，＊＊P ＜0.01;與ISO 組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)心肌病理改變平均秩次正常對照 —- + + + + + +8 0 0 0 8.5單用氧化苦參堿 100 8 0 0 0 8.5 ISO 5 0 0 2 6 34.88＊＊ISO+氧化苦參堿 100 0 4 4 0 24.25##50 0 3 4 1 26.38#

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化的觀察(HE 染色400×)

3.3 各組大鼠血清ET-1、NO 和心肌組織NO 水平 與正常對照組相比較，單用氧化苦參堿組血清ET-1、NO 水平和心肌組織NO 水平無顯著性差異。ISO 組血清ET-1、NO水平顯著增高(P ＜0.01)，心肌組織NO 水平明顯降低(P ＜0.05);與ISO 組比較，氧化苦參堿 (100 和50 mg/kg)組ET-1 水平降低(P ＜0.01)，而心肌組織NO 水平升高(P ＜0.05)，但對升高的血清NO 水平無影響(P ＞0.05)。提示氧化苦參堿對心力衰竭大鼠損傷的內皮功能具有保護作用。結果見表3。

3.4 各組大鼠心肌組織eNOS 的表達 與正常對照組比較，單用氧化苦參堿組心肌組織eNOS 表達無顯著差異，ISO 組大鼠心肌eNOS 的表達顯著降低(P ＜0.01)。氧化苦參堿各組eNOS 表達與ISO 組比較顯著升高(P ＜0.05)。提示氧化苦參堿可通過提高心肌組織eNOS 表達而增加心肌NO 水平。結果見圖2 和圖3。

表3 氧化苦參堿對ISO 誘導的心力衰竭大鼠ET-1 和NO 水平的影響(±s，n=8)

表3 氧化苦參堿對ISO 誘導的心力衰竭大鼠ET-1 和NO 水平的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與ISO 組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) 血清ET-1/(pg·mL -1) 血清NO/(pg·mL -1) 心肌組織NO/(μmol·gprot -1)正常對照單用氧化苦參堿—0.33 ±0.05 0.28 ±0.06 ISO 5 88.55 ±5.35 ＊＊ 580.55 ±78.61 ＊＊ 0.21 ±0.03 *ISO+氧化苦參堿 100 72.22 ±11.26 ## 553.56 ±49.67 * 0.33 ±0.05 ##50 72.36 ±13.62 ## 569.71 ±139.79 * 0.28 ±0.08 100 68.11 ±4.63 60.93 ±4.40 418.73 ±33.13 500.09 ±106.37#

圖2 Western blotting 檢測大鼠左心室組織中eNOS 蛋白表達圖像

圖3 比較大鼠左心室組織中eNOS 蛋白表達的柱狀圖(±s，n=6)

4 討論

氧化苦參堿具有廣泛的藥理學作用，已用于治療乙型肝炎、抗肝纖維化和抗腫瘤輔助治療［1］，研究表明，氧化苦參堿對心血管系統具有對抗急性心肌缺血、減少左冠狀動脈前降支結扎所致大鼠心肌梗死的梗死范圍，改善心力衰竭大鼠的心功能等作用［1-3］，但其在心血管系統中抑制心肌肥厚和保護心力衰竭的作用機制研究仍較少。本實驗室前期研究證實氧化苦參堿是通過調控ADMA 代謝通路發揮抑制心力衰竭作用的［8］。為此本實驗進一步探討氧化苦參堿抑制慢性心力衰竭及心肌肥厚可能的機制。結果表明，氧化苦參堿抑制ISO 致心力衰竭大鼠心肌肥厚作用的機制可能與減少血清ET-1 的生成，調控心肌組織NO 水平及eNOS 表達有關。

心肌肥厚是心臟對持續性超負荷的一種適應性反應，長期心肌肥厚是導致心力衰竭的重要因素之一［6，9］。異丙腎上腺素5 mg/kg 連續給藥7 d，可導致心肌細胞肥大，膠原纖維增生，心肌肥厚發生，同時心功能下降心力衰竭，該方法作為研究心力衰竭的藥理試驗動物模型被廣泛使用［9-10］。本實驗結果表明，與正常對照組相比，ISO 組HW/BW 和LVW/BW 顯著增大，與相關報道結果一致［9-10］。氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可明顯降低心衰大鼠HW/BW 和LVW/BW，說明氧化苦參堿具有抑制心肌肥厚的作用。心肌病理組織觀察及病理分級統計結果顯示ISO 組心肌纖維化嚴重，氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可明顯減少ISO 所致心力衰竭大鼠心肌纖維化，進一步改善心室重構［8，10］。

ET-1 是一種強的縮血管因子，也是一種炎癥因子，具有促細胞生長和促有絲分裂的特性，ET-1 的過度產生與心肌肥厚及心力衰竭的發生密切相關［4-5］。研究表明，在心衰患者及動物的體內，血清ET-1 水平顯著增高［5，12］。NO 是由內皮細胞中的內皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸(L-Arg)而生成的［6-7］。其是目前已知最強的擴張血管因子之一，在心肌代償性肥厚時，NO 的增多可以減緩心肌肥厚的進程，是阻止心室重構的重要因素之一［6］。而內源性NO 的減少可減弱舒血管效應，加重心力衰竭［4，6］。近年來的諸多研究表明，ET-1 和NO 均是由內皮細胞產生的，兩者共同維持血管張力，調節血管內皮功能平衡［13］。心力衰竭時，ET-1 和NO 存在相互制約的關系，ET-1 可刺激NO 的釋放增多，而NO 又可抑制ET-1 的合成［14］。因此，心力衰竭時內皮功能失調與ET-1 和NO 的平衡失調直接相關，降低血清ET-1 并提高NO 水平對抑制心肌肥厚和抗心力衰竭有益［13-14］。本實驗結果顯示，ISO 可使大鼠血清ET-1 和NO 水平升高，心肌組織NO 水平降低，與前人報道結果一致［12，15］。氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可使ISO 誘導心力衰竭大鼠血清ET-1 水平明顯下降并使心肌組織NO的水平明顯增加，但對血清升高的NO 無影響。提示氧化苦參堿抑制心肌肥厚和逆轉心力衰竭在降低血清ET-1 同時，保留了NO 的舒血管作用。此外，內源性NO 的產生有賴于eNOS 的活性和表達，eNOS 表達減少，NO 生物活性的下降則加重心力衰竭的發展［16］。對心臟特異性eNOS 過表達轉基因小鼠研究表明，eNOS 過表達轉基因小鼠冠脈結扎后左室收縮功能和舒張功能有所改善，左室肥厚和心肌肥厚減輕［16］。因此，恢復和增強eNOS 活性，增加NO 水平可抑制心力衰竭所致的心臟重構［9］。本實驗研究表明，ISO 所致的心力衰竭大鼠模型中eNOS 的表達顯著降低，與文獻報道一致［15，17］。氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可使心肌組織eNOS 的表達明顯增加，提示氧化苦參堿抑制心力衰竭大鼠心肌肥厚與上調心肌組織eNOS 表達有關，從而增加心肌組織NO 水平。

綜上所述，氧化苦參堿可減輕ISO 致心力衰竭大鼠的心肌肥厚，改善心肌病理變化，對ISO 致大鼠心力衰竭具有保護作用。該作用機制與抑制大鼠血清ET-1 的水平，增加心肌組織NO 水平和上調eNOS 表達有關。

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