HPLC 法測定枳殼不同炮制品中活性成分

張金蓮， 曾昭君， 李志強， 魏 瑩， 楊武亮， 余書琦

(江西中醫藥大學，江西 南昌330004)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L. 及其栽培變種的干燥未成熟果實，7 月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥，具有理氣寬中，行滯消脹的功效，主要用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內停，臟器下垂［1］。枳殼的主要化學成分有黃酮類化合物、揮發油、香豆素類及少量的生物堿類等［2］，是枳殼藥理作用研究的主要物質基礎。而其主要活性成分包括黃酮苷類和脂溶性成分，其中黃酮苷類主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等，脂溶性成分主要有桔皮素、川陳皮素、水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏和葡萄內酯［3］。有研究報道［4-5］枳殼脂溶性部位提取物對胃腸平滑肌有雙向調節作用，小劑量對正常小鼠胃腸運動有促進作用，大劑量則有抑制作用。本實驗采用RP-HPLC 法對生品、藥典法、樟幫生品、樟幫法及建昌幫法枳殼中9 個活性成分進行定量測定比較，為合理制定其炮制工藝及控制炮制品的質量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 高效液相色譜儀(Ultimate3000 柱溫箱，VWD 檢測器，Chromeleon 7.10色譜工作站)，Sartoris. BT224S (萬分之一天平)，Mettle AE240 (瑞士，十萬分之一天平)。KQ-3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，YF-111 二兩裝高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司)，SZ-93 自動雙重純水蒸餾器(上海雅榮生化儀器設備有限公司)，SHZ-D (Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市華儀器有限責任公司)，RE-52 旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯對照品(自制，1H-NMR、13C-NMR、ESIMS 鑒定，HPLC 峰面積歸一化法計算純度不低于98.0%)，乙腈(Tedia 產，色譜純)，甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。枳殼藥材為2012 年夏采集于江西省新干縣三湖鎮，經江西中醫藥大學楊武亮教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L. 的干燥未成熟果實。

2 方法與結果

2.1 不同炮制品的制備

2.1.1 生品 取原藥材，挖去內瓤，洗凈，潤軟，切薄片，低溫干燥。

2.1.2 藥典法［1］取生品枳殼片，先將炒制容器加熱，至撒入麩皮即刻煙起，隨即投入枳殼片，迅速翻動，炒至表面呈黃色或深黃色時，取出，篩去麩皮，放涼。每100 kg 枳殼，用麩皮10 ～15 kg。

2.1.3 樟(樹)幫生品［6］取原藥材，挖去內瓤，洗凈，潤過夜，用鐵錨壓扁，再上木架3 ～5 d，稍見霉點使對合成扁半圓形，切成0.2 cm 厚的“鳳眼片”，曬干。

2.1.4 樟(樹)幫法［6］將炒制容器加熱，取麥麩撒于鍋內，待濃白煙起，加入曬干的樟幫生品枳殼片，不斷翻動，炒至淡黃色時取出，篩去焦麩皮，放涼。每100 kg 枳殼，用麩皮5 ～10 kg。

2.1.5 建昌幫法［7］取原藥材，加熱水浸泡5 ～10 min，瀝干，用濕麻布悶潤1d，潤軟后挖去內瓤，用鐵錨壓扁，再上木架定形，曬2 ～3 d，至表皮水分干燥后橫切成“人字片”，再曬至全干。再將炒制容器加熱，取蜜麩撒于鍋內，待濃白煙起，加入曬干的枳殼片，快速翻炒1 ～2 min，炒至淡黃色時快速取出，篩去焦麩皮，入容器內密閉轉黃色即得。每100 kg 枳殼，用蜜麩50 kg。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 黃酮苷類制備［8］取枳殼飲片粉末(40目)約0.5 g，置100 mL 圓底燒瓶中，加甲醇水浴加熱回流1.5 h 后，趁熱濾過，濾液置50 mL 量瓶中，藥渣再提取2 次(每次加10 mL 甲醇提取10 min)，濾液置同一量瓶中，待冷卻后加甲醇至刻度，搖勻，準確取出5 mL 轉移至25 mL 量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm 濾膜過濾，續濾液為供試品溶液。

2.2.2 脂溶性成分制備 取枳殼炮制品中粉約0.5 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL 水浴回流1.5 h，過濾合并醇提液，用旋轉蒸發儀減壓回收甲醇，得浸膏，加入40 mL蒸餾水，加熱溶解，分次洗滌(2 ∶1 ∶1)成水混懸液，待水液冷卻后，移至分液漏斗中，以等體積三氯甲烷萃取兩次，收集下層脂溶性部位。減壓回收溶劑至干。殘渣用色譜純甲醇溶解并洗滌，定容于10 mL 量瓶中，過0.45 μm 的微孔濾膜，取續濾液即得。

2.3 對照品溶液的制備 取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯對照品適量，精密稱定，加甲醇分別配制得到柚皮苷155.93 μg/mL、橙皮苷138.36 μg/mL 和新橙皮苷87.19 μg/mL 的混合對照品溶液;水合橘皮內酯58.08 μg/mL、橘皮內酯38.29 μg/mL、馬爾敏19.90 μg/mL、川陳皮素35.01 μg/mL、桔皮素34.02 μg/mL 和葡萄內酯29.50 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件

2.4.1 黃 酮 苷類 測 定［8］Diamonsil C18色 譜 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(磷酸調pH 3) (23 ∶77)，檢測波長283 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。樣品及對照品色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)、樣品(B)和甲醇溶劑(C)HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，samples (B)and methanol (C)

2.4.2 脂溶性成分測定［3］Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-水(B)，體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長324 nm，進樣量10 μL。二元梯度洗脫:0 ～6 min，49%A;6 ～15 min，49% ～75%A;15 ～26 min，75% ～100%A;26 ～30 min，100%A。樣品及對照品色譜圖見圖2。

圖2 對照品(A)和樣品(B)HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and samples (B)

2.5 線性關系考察 精密吸取脂溶性成分各對照品適量進樣，分別按上述色譜條件進行測定，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，得水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯的線性方程分別為y =26.535x +5.691 (r =0.999 4)，y=29.893x +3.93 (r =0.999 9)，y =25.097x + 1.796 (r = 0.999 7)，y = 34.703x +3.401 (r = 0.999 8)，y = 42.995x + 5.407 (r =0.999 9)，y =25.302x +3.505 (r =0.999 5)，線性范圍分別為35.8 ～180.6 ng、22.7 ～949 ng、12.7 ～668 ng、20.6 ～110.5 ng、20.7 ～1 059 ng、7.5 ～617 ng。

2.6 精密度試驗 精密移取各對照品適量，進樣，分別按上述色譜條件測定，結果水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯峰面積RSD (n =6)分別為2.0%，1.8%、2.1%、1.4%、1.3%、2.5%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取脂溶性供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，按相應色譜條件測定，結果水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯峰面積RSD 分別為0.9%、1.4%、1.7%、0.8%、2.0%、2.6%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.8 重復性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液各5 份，按相應的色譜條件進行測定，結果水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯含有量的RSD 分別為1.7%、2.2%、2.3%、1.6%、1.9%、2.3%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含有量的枳殼粉末0.25 g，精密稱定，共6 份，各精密加入水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯質量濃度分別為0.81、0.74、0.17、0.64、0.42、0.16 g/L 的混合對照品溶液1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下條件測定，計算平均回收率分別為97.2%(RSD 2.8%)，98.7% (RSD 2.5%)，99.0%(RSD 2.7%)，98.3% (RSD 2.8%)，103.6%(RSD 2.6%)，101.7% (RSD 2.7%)。

2.10 枳殼不同炮制品中活性成分測定 分別取不同炮制品枳殼，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液， “2.4”項下色譜條件，采用外標一點法計算枳殼不同炮制品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素和葡萄內酯的量。結果見表1。

表1 樣品測定結果(n=3)Tab.1 Content determination of samples (n=3)

3 討論

實驗結果表明，不同炮制方法枳殼飲片中黃酮苷類及脂溶性成分均存在差異。與生品相比，枳殼經藥典法、樟幫法及建昌幫法炮制后其黃酮苷類成分柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷的量均增加，而經發酵的樟幫生品黃酮苷類成分的量減少，其黃酮苷類含有量依次為:建昌幫法﹥樟幫法﹥藥典法﹥生品﹥樟幫生品;而與生品相比，枳殼經藥典法、樟幫法及建昌幫法炮制后其脂溶性成分含有量水合橘皮內酯、橘皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、桔皮素均呈下降趨勢，而經發酵的樟幫生品各脂溶性成分呈升高趨勢，脂溶性成分含有量依次為:樟幫生品﹥生品﹥藥典法﹥樟幫法﹥建昌幫法。從實驗結果可知，枳殼經麩或蜜麩加熱炒制后黃酮苷類成分呈上升趨勢，脂溶性成分呈下降趨勢;而經發酵霉變后枳殼黃酮苷類成分的量明顯下降，脂溶性成分的量明顯上升。這可為今后進一步研究枳殼炮制工藝和枳殼炮制后活性成分的轉化提供一定參考依據。

枳殼的炮制目的主要是“緩燥增效”。傳統中醫藥理論認為“枳殼麩炒以緩和其峻烈之性而免傷元氣”［9］， “麥麩皮制，抑酷性勿傷上膈”［10］。而目前研究亦認為枳殼麩炒可降其揮發油的含有量，去除刺激成分，緩和燥性［11］。而其燥性是否與黃酮苷類與脂溶性成分的增減或是各活性成分之間的比例變化相關，有待選擇科學合理的藥理模型進一步深入研究。

枳殼的主要功效是理氣寬中，行滯消脹。《中國藥典》2010 年版以黃酮苷類成分含有量為判定枳殼質量優劣的指標成分，實驗結果表明，建昌幫法炮制枳殼中黃酮苷類成分的量高于其他各炮制法，故枳殼建昌幫法炮制值得推廣應用。文獻［4-5，12］報道枳殼脂溶性部位提取物對胃腸平滑肌有雙向調節作用，小劑量對正常小鼠胃腸運動有促進作用，大劑量則有抑制作用。枳殼的臨床常用劑量是3 ～10 g，在常規劑量內枳殼不同炮制品的脂溶性成分的煎出量對胃腸運動是促進還是抑制，未見有相關文獻報道，可對其進一步研究，從而為探索枳殼的炮制機理及控制炮制品的質量提供更為科學合理的依據。

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