分式析因設計結合Box-Behnken 效應面法優化蒿甲醚納米粒的制備

吳 璐， 高文軍， 王 芳， 楊華生

(江西中醫藥大學，江西 南昌330004)

近年來研究發現，青蒿素類藥物不僅可以選擇性抑制和(或)殺滅多種腫瘤細胞，而且具有很好的耐受性，毒副反應也很少［1］，尤其重要的是，它對多藥耐藥的腫瘤細胞具有活性［2］。蒿甲醚(artemether)是青蒿素 (artemisinin)的衍生物，研究［3］發現，蒿甲醚可以降低嗜鉻細胞瘤(PCI2)細胞的活性，其主要作用機制是引起細胞線粒體的損傷并抑制線粒體呼吸鏈復合酶I 和Ⅳ的活性，導致細胞死亡，從而發揮抗腫瘤作用。蒿甲醚存在代謝快、作用時間短、生物利用度低、臨床上服用劑量大、需長期給藥且復燃率高等缺點，為解決上述問題，將其制成生物降解的納米粒 (nanopaticles)。分式析因設計 (fractional factorial design)是一種高效率的實驗設計方法，不僅能夠分析各因素內部不同水平間有無差別，還具有分析各種組合的交互作用的功能，能用較小次數的實驗檢查大量的因素，并從中找到具有顯著意義的因素。Box-Behnken 設計是國外近年常用的實驗優化方法，與國內常用的正交設計法及均勻設計法相比，具有可采用非線性擬合的特點，其結果可采用集數學和統計學方法于一體的效應面法 (response surface methodology，RSM )進行優化［4-8］。本研究在分式析因設計優選考察因素基礎上采用Box-Behnken 設計-效應面法，預測蒿甲醚聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)納米粒的最佳制備工藝條件。

1 材料

HP1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);81-2 型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠);GB204 電子天平(瑞士梅特勒公司);SARMorius BT 25S 電子天平 (德國賽多利斯公司);JEM 100CX-II 透射電鏡(日本電子株式會社);90Plus激光粒度測定儀(美國布魯克文儀器公司)。蒿甲醚對照品(編號100271-200502，供含量測定，中國食品藥品檢定研究院)，乳酸乙醇酸共聚物(PLGA，分子質量20 000，濟南健寶開元生物材料有限公司)，聚乙烯醇(PVA，88%醇解度，分子質量22 000，比利時ACROS 試劑公司)，泊洛沙姆188 (上海源葉生物科技有限公司)。乙腈色譜純(Burdick ＆ Jackson 公司)，甲醇色譜純(天津康科德科技有限公司)，雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 蒿甲醚納米粒的制備 采用沉淀法，稱取處方量的蒿甲醚和PLGA，溶于適量丙酮中，形成有機相。另取一定量的PVA 和泊洛沙姆188 溶于水中，形成水相。在勻速攪拌條件下，將上述有機相緩緩加入到水相中，40 ℃減壓旋蒸除去有機溶劑，過0.8 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 包封率、載藥量的HPLC 測定

2.2.1 色譜條件［9］Cromasil 色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填合劑;以乙腈-水(65 ∶35)為流動相;檢測波長為254 nm;體積流量為1.0 mL/min。

2.2.2 標準曲線、精密度及回收率 方法學考察表明輔料對測定無干擾，標準曲線為Y=10.769X +6.939 4，r = 0.999 7，表明在 (0.124 ～49.6)μg/mL 的質量濃度范圍內線性良好。精密度、穩定性、回收率均符合要求。

2.2.3 包封率和載藥量的測定［10］采用反透析的方法測定蒿甲醚PLGA 納米粒的包封率和載藥量。取平行操作空白溶液0.5 mL 置于預先用水飽和透析袋內，兩端扎緊，放入制備好的納米粒膠體溶液中(n =3)，于振蕩儀(25 ℃，80 r/min)振搖，透析24 h。精密吸取透析袋內液，用高效液相色譜法測定游離藥物質量濃度。包封率和載藥量計算公式如下:

包封率= ［(投藥量- 游離藥物量)/投藥量］×100%

載藥量=［(投藥量-游離藥物量)/納米粒的質量］×100%

2.3 分式析因設計

2.3.1 考察因素的選擇與試驗設計 從蒿甲醚PLGA 納米粒的制備工藝和處方因素中選擇PVA 質量分數(A)、藥物在有機相中的質量濃度(B)、泊洛沙姆188 質量分數(C)、PLGA 與藥物的用量比(D)、水相與有機相的體積比(E)、攪拌速度(F)為考察因素，以包封率 (Y1)和載藥量(Y2)作為響應指標，采用Design Expert 7.1.3 設計軟件進行分式析因設計，安排16 (26-2)次試驗，試驗因素水平表及試驗設計結果見表1 和表2。

表1 分式析因設計試驗因素水平Tab.1 Factors and levels in fractional factorial experiment

2.3.2 方差分析與因素的優選 采用Design Expert 7.1.3 設計軟件對各因素進行擬合及方差分析后得到各因素的回歸系數和顯著性水平見表3。

表2 分式析因設計試驗設計及結果Tab.2 Design and results for fractional factorial experiment

表3 各因素的回歸系數和顯著性水平Tab.3 Regression coefficient and significance level of each factor

2.4 Box-Behnken 設計-效應面法優化處方工藝

2.4.1 模型擬合及方差分析 在分式析因設計試驗基礎上，以藥物在有機相中的質量濃度(X1)、泊洛沙姆188 質量分數(X2)、PLGA 與藥物的用量比(X3)作為考察因素，以包封率(Y1)和載藥量 (Y2)作為響應指標，采用 Design Expert7.1.3 設計軟件安排3 因素3 水平的試驗方案，試驗因素水平表及試驗設計結果見表4 ～5。

表4 Box-Behnken 試驗因素水平及編碼Tab.4 Levels and codings for Box-Behnken experimental factors

表5 Box-Behnken 試驗設計及結果Tab.5 Design and results of Box-Behnken experiment

2.4.2 效應曲面優化及預測 利用擬合方程預測最優處方，由擬合所得模型繪制X1、X2和X3對Y1和Y2的效應曲面圖，結果見圖1。

由Design Expert 7.1.3 分析結果可知，蒿甲醚納米粒的包封率Y1受X3的影響最為顯著，隨著PLGA 與藥物的用量比值增加，包封率增加;蒿甲醚納米粒的載藥量Y2受X1、X3影響顯著，隨著藥物在有機相中的質量濃度增加，載藥量增加;隨著PLGA 與藥物的用量比值增加，載藥量減少，與單因素試驗結果一致。

2.4.3 優化工藝驗證 根據綜合評價，得最佳工藝參數:X1=1.74，X2=2.32，X3=14.38。照此條件制備了3 批蒿甲醚PLGA 納米粒，與模型預測值進行比較，3 批制劑所獲得的實測值與預測值基本一致，偏差的絕對值均＜10%，結果見表7，說明所建立的擬合模型具有良好的預測性。對最優工藝制備的納米粒進行粒徑測定、透射電鏡觀察，結果見圖2 ～3，蒿甲醚PLGA 納米粒的平均粒徑為135.4nm，多分散性指數為0.278。

表6 二次多項式回歸方差分析表Tab.6 Variances analyses of two degree polynomial regression

圖1 藥物在有機相中質量濃度與泊洛沙姆188 質量分數對包封率和載藥量的影響效應曲面圖Fig.1 Response surface graphs of entrapment efficiency and drug loading rate effected by drug concentration in the organic phase and poloxamer 188 concentration

表7 驗證試驗結果(±s，n=3)Tab.7 Proof test results (±s，n=3)

表7 驗證試驗結果(±s，n=3)Tab.7 Proof test results (±s，n=3)

注:偏差= (預測值-實測值) ×100%

參數 預測值/% 實測值/% 偏差/%Y1 80.16 77.19 ±4.10 3.71 Y2 5.26 5.01 ±4.03 4.75

圖2 蒿甲醚PLGA 納米粒的粒徑分布Fig.2 Size distribution of artemether PLGA nanoparticles

圖3 蒿甲醚PLGA 納米粒的透射電鏡照片(×3 ×104)Fig.3 TEM images of artemether PLGA nanoparticles(×3 ×104)

3 討論

納米技術的興起與發展，為攻克疾病治療上的難題帶來了新的希望。聚乳酸 (polylactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)及它們的聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA 等聚酯類材料由于具有良好的生物降解性能，是迄今為止研究最多、應用最廣的可生物降解的合成高分子材料之一，在納米粒研究中得到廣泛應用［11-14］。將蒿甲醚制備成納米制劑能提高蒿甲醚的生物利用度，達到靶向、緩釋的作用，本實驗對蒿甲醚納米新型給藥系統的研究提供一定理論基礎。

聚酯型高分子材料作為藥物載體，存在對成分的選擇性吸附問題，藥物主要以兩種方式存在于納米粒中:一種方式是包裹在其中，另一種方式是被吸附于表面。因此，制得的納米粒的包封率和載藥量與載體的性質和藥物的性質有較大的關系。藥物與載體的親和力決定了包裹的難易，脂溶性較大的藥物與脂溶性強的載體有較大的親和力，水溶性較強的藥物與脂溶性較小、水溶性較強的載體有較好的親和力;此外，藥物能否與載體形成分子間的共價鍵、氫鍵等也對其包載效果有較大的影響。

采用多指標優化實驗，各指標的優選條件可能會相互矛盾，即對某一指標有利的條件可能對其他指標不利，這時，可采用綜合指標(overall desirability)來考察指標的綜合效果。由于本實驗中的2個指標均欲達到最大值，對因素水平的選擇趨勢一致，因此不再采用綜合指標來優化工藝。

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