載漢黃芩素的mPEG-PLGA 納米粒的制備及體外評價

沈 熊， 許根英， 董 穎， 梁 健， 呂遷洲 ， 許 青

(復旦大學附屬中山醫院藥劑科，上海200032)

漢黃芩素(wogonin，Wo)是從唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi、半枝蓮Scutellaria barbata D. Don 以及夾竹桃科植物鱔藤Anodendron affine (Hook. et Arn)Druce 等植物中分離或者通過合成得到的黃酮類化合物［1］，具有抗炎、抗腫瘤等廣泛的治療作用［1-4］。同很多黃酮類化合物一樣，漢黃芩素存在水溶性差、吸收后易被代謝等缺陷［5-6］。文獻報道將漢黃芩素制成脂質體［7］、固體脂質納米粒［8］、白蛋白微球等［9］可以達到緩釋、靶向給藥、提高生物利用度等效果。同時也報道了血漿對漢黃芩素脂質體的穩定性有一定影響，血漿中的調理素等成分可能影響脂質體的緩釋效果［7］。因此，選擇適當的載體制備漢黃芩素納米粒，在保留緩釋的基礎上增加長循環特性，提高藥物穩定性，以提高藥物吸收和生物利用度［10-11］，有助于漢黃芩素的開發利用。

乳酸-羥基乙酸共聚物［poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA］是一類可生物降解的高分子材料，具有良好的生物相容性和體內安全性，已被美國FDA 錄用為藥用輔料，被廣泛用做納米載藥系統的載體。在PLGA 納米粒表面修飾親水性材料，如聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)等，可以提高其親水性，靜脈注射給藥后可以降低被血漿中酶系統降解的程度，且不易被單核吞噬細胞系統識別吞噬，延長藥物的體內循環時間，提高生物利用度［12］。

本實驗以單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)為載體，采用溶劑擴散法制備載漢黃芩素的納米粒(Wo-mPEG-PLGA NPs)，考察其形態、載藥性能、血清穩定性和體外釋放行為等指標。

1 儀器與材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);Zetasizer Nano ZS 納米粒度及Zeta 電位分析儀(英國Malvern 公司);JY 92-II DN 超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Eppendorf 5430 R 小型臺式高速離心機［艾本德(上海)國際貿易有限公司］;VOS-90AG 真空干燥箱［施都凱儀器設備 (上海)有限公司］;Tecnai G220 透射電子顯微鏡 (荷蘭 FEI 公司);UV760CRT 雙光束紫外可見分光光度計(日本島津);SHZ-B 型恒溫水浴振蕩器(上海躍進醫療器械廠)。

漢黃芩素原料藥(上海同田生物技術有限公司，純度≥98.5%，批號20121210);漢黃芩素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110773—201011);單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA，mPEG 相對分子質量為2 000，PLGA，相對分子質量為30 000，LA ∶GA =75 ∶25，濟南岱罡生物科技有限公司);胎牛血清(美國Sigma 公司);泊洛沙姆188 (Pluronic F-68，德國BASF 公司);甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 納米粒的制備 采用溶劑擴散法制備納米粒，室溫下精密稱取2.5 mg 漢黃芩素和50 mg mPEGPLGA 溶解于2.5 mL 丙酮作為有機相，磁力攪拌下注入到25 mL 含有0.5% (m/V)Pluronic F-68的水相中，加完后超聲45 s (輸出功率200 W)，繼續攪拌20 min，60 ℃磁力攪拌下除去有機溶劑，0.45 μm 微孔濾膜濾過，低溫超速離心(21 000×g，45 min，4 ℃)，棄去上清液，收集納米粒，加10 mL 水分散后再次離心，如此重復2 次，取納米粒減壓干燥(-0.08 MPa，50 ℃)，即得漢黃芩素納米粒，稱定質量，記為mNP。取該納米粒約20 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加適量水超聲分散，加水稀釋至刻度，搖勻，記為“漢黃芩素納米混懸液A”。

2.2 納米粒的表征

2.2.1 掃描電鏡(SEM)觀察 取1 ～2 滴漢黃芩素納米混懸液A 滴于銅網上，用1.0%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干后置透射電鏡下觀察，可見所得Wo-mPEG-PLGA NPs 呈球形，表面較光滑，大小均勻，分散性好，粒徑約100 nm。

2.2.2 粒徑及ζ電位 取漢黃芩素納米混懸液A 加水稀釋5 倍，用粒度儀測定粒徑和ζ電位。測得Wo-mPEG-PLGA NPs 的平均粒徑為 (112 ± 33)nm，ζ電位為(-23.71 ±2.95)mV (n=3)。

2.2.3 血清穩定性 按文獻方法［13］，取1 mL 漢黃芩素納米混懸液A 與等體積50% 胎牛血清混合均勻，于37 ℃孵育24 h，取樣，于檢測波長750 nm，以50%胎牛血清透光率(T%)為100%，測得孵育后的溶液透光率為(99.02 ±0.27)% (n =3)，未見納米粒凝聚現象，說明37 ℃下24 h 內納米粒在血清中保持穩定。

2.3 Wo-mPEG-PLGA NPs 載藥量的測定

2.3.1 HPLC 條件和方法學驗證 按文獻方法［7，14］，采用HPLC 法測定Wo-PLGA NPs 的載藥量。Luna C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，美國菲羅門公司);流動相為甲醇-水-三氟乙酸(60 ∶40 ∶0.05);體積流量1 mL/min，檢測波長275 nm;柱溫30 ℃;進樣量20 μL。

取漢黃芩素約10 mg，精密稱定。加適量甲醇溶解，并稀釋至 25 mL，制成質量濃度為400 μg/mL的貯備液，用流動相稀釋成質量濃度為0.1 ～5.0 μg/mL 的系列漢黃芩素對照品溶液，按上述方法進樣分析，以峰面積對漢黃芩素質量濃度做線性回歸，制備標準曲線。結果顯示漢黃芩素在此質量濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為:A=4.68 ×103+3.12 ×105C (r=0.999 8)，其中A為漢黃芩素色譜峰的峰面積，C 為對照品質量濃度(μg/mL)。以漢黃芩素峰面積計，低、中、高3 種質量濃度對照品溶液(0.2、2.5、5.0 μg/mL)的日內和日間相對標準偏差 (RSD)均小于2%(n=5);方法回收率分別為 (99.21 ±1.62)%、(101.67 ±1.76)% 和(100.45 ±1.20)%，方法的準確性良好。

2.3.2 載藥量的測定 取“2.1”項下制得納米粒10 mg，精密稱定，加入2 mL 乙腈-水(9 ∶1)溶解載體材料使漢黃芩素釋放出，轉移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1 mL轉移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，按“2.3.1”項下方法進樣，測定漢黃芩素量，記為mE，即納米粒包封的漢黃芩素量，根據下列公式計算載藥量(Drug Loading，DL):

其中，mNP為測定取用的納米粒的質量(10 mg)，得納米粒的平均載藥量為(3.27 ±0.04)%(n=3)。

2.4 Wo-mPEG-PLGA NPs 的體外釋放試驗 采用透析法考察納米粒的體外釋藥。按“2.1”項下方法制備，得納米粒約42.7 mg，精密稱定，加適量水超聲分散，轉移至10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL 約含140 μg 漢黃芩素的混懸液，記為“漢黃芩素納米混懸液B”。

精密吸取0.5 mL 漢黃芩素納米混懸液B，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4，以下簡稱PBS)，混合均勻，置透析袋(截留分子質量15 000)中，兩端扎緊，置50 mL PBS 中，(37 ±0.5)℃下恒溫水浴中水平振蕩(100 次/min，振幅20 mm)，定時取透析外液，同時補充等量等溫的PBS 至釋放介質，將取出的溶液離心后按“2.3.1”項下條件測定，計算漢黃芩素量和累積釋放率。

精密吸取0.5 mL 漢黃芩素納米混懸液B，加入1 mL血漿，漩渦混勻，置透析袋中，同法測定累積釋放率，考察血漿對納米粒釋放的影響。

取漢黃芩素原藥約5 mg，精密稱定，加適量助溶劑溶解于水中，制成約為140 μg/mL 的混懸液，同法考察累積釋放率，結果見圖1。

圖1 體外釋放曲線(n=6)Fig.1 Profile for in vitro release (n=6)

結果可見，漢黃芩素溶液從透析袋中迅速釋放，在4 h 內釋放完全。分散于PBS 的Wo-mPEGPLGA NPs 在0 ～3 h 釋藥較快，3 h 至12 h 釋放減慢，12 h 以后逐漸趨于平緩，24 h 累積釋放率約為39%，說明Wo-mPEG-PLGA NPs 具有緩釋效應。納米粒先與血漿混合后，其釋放曲線與納米粒分散于PBS 中的釋放行為類似，在0 ～3 h 的各時間點基本重疊，3 ～12 h 的釋放度略高于前者，24 h 時累積釋放率約為42%，說明血漿對納米粒的釋放度影響不明顯。

3 討論

本研究用以mPEG-PLGA 為載體材料，采用溶劑擴散法制備了載漢黃芩素的納米粒，表征納米粒，并考察其體外釋放特性。

納米粒溶液在血清中的凝聚特性是其穩定性的重要指標［13］。本研究采用納米混懸液在50%胎牛血清中孵育后測定透光率(T%)的方法考察其穩定性。因為透光率(T%)的范圍為0 ～100%，便于直觀比較，所以采用測定透光率(T%)而不是吸收度(A)的方法。以50%胎牛血清透光率為100%，納米溶液孵育24 h 后透光率為(99.02 ±0.27)% (n =3)，可見納米溶液在血清中凝聚程度輕微，穩定性良好。

體外釋放度試驗結果表明，漢黃芩素原藥在4 h內釋放完全，這與文獻報道一致［7］。而WomPEG-PLGA NPs 在4 h 時的釋放度約為21%，呈現明顯的緩釋效果。納米粒分散于血漿后進行的釋放試驗表明，血漿對納米粒的釋放影響不明顯，其釋放行為與納米粒分散于PBS 基本一致。結合穩定性試驗結果推測，以mPEG-PLGA 為載體制備漢黃芩素納米粒可以減少血漿調理素的影響，從而具備長循環的特性［15］。接下來可進行體內試驗來進一步驗證其緩釋和長循環的特性，為漢黃芩素的新劑型研發提供幫助。

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