分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定中成藥中展青霉素

鄧 鳴， 朱 斌* ， 賓春燕

(1. 廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧530021;2. 廣西醫科大學，廣西 南寧530021)

展青霉素是擴展青霉、展青霉、圓弧青霉等真菌的次級代謝產物，是一種遺傳毒性化合物，存在致畸性、致癌性和免疫毒性［1］。由于展青霉素對人類可能造成的危害，世界上許多國家都規定了食品中展青霉素的限量值，我國國標GB 2761 -2011《食品中真菌毒素限量》中規定展青霉素的限量為50 μg/kg。展青霉素主要存在酸性果實中，在蘋果、山楂及其制品中檢出較多［2-3］。中藥及中成藥中亦有許多酸性果實類藥材入藥，但目前展青霉素檢測研究報道多集中于果實類食品而關于中藥相應檢測方法報道較少。山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒的主要原料均為山楂、麥芽及六神曲，這些中藥材有可能受到真菌毒素污染，因此有必要檢查其中展青霉素量，保證用藥安全。

近幾年來測定展青霉素的方法主要有高效液相色譜法［4-7］以及高效液相色譜-質譜聯用法［8-10］，前處理方法有液液萃取 法［4，7］、固 相 萃 取 法［8，11］、多 功 能 凈 化 柱 凈 化法［5，10］等。液液萃取法的提取溶劑為乙酸乙酯，需消耗較多有機溶劑，操作步驟較為繁瑣。固相萃取法常用C18或HLB 小柱進行提取液的凈化，與液液萃取方法相比，樣品用量和溶劑用量均明顯減少，樣品的純化和富集過程可同時完成，縮短樣品處理時間。多功能凈化柱可選擇性吸附樣液中的雜質，而待測組分真菌毒素不被吸附而直接通過，該方法操作步驟簡單，凈化過程一步完成，已越來越多地應用于展青霉素測定中。分子印跡固相萃取柱，是運用分子印跡技術(molecular imprinting technique，MIT)原理，模擬抗原抗體反應模式，將樣品中的目標分子進行特異性提純處理和富集。目前針對真菌毒素的分子印跡固相萃取柱的使用已經有了一定的發展，并得到了廣泛的關注［12］。實驗中成功運用了展青霉素分子印跡柱對中成藥提取液進行凈化，其凈化過程迅速，選擇性高，可有效去除中藥中眾多干擾物質。該方法的建立為更好地評價和控制山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒質量提供依據，也為其他中成藥中的展青霉素測定提供參考方法。

1 儀器與材料

Agilent1200 型液相色譜儀(Agilent 公司);Milli-Q 去離子水發生器(Milli-Q 公司);OA-SYS 氮吹儀(Ttettich公司)。

展青霉素(patulin)對照品購于Supelco 公司，批號LB81487，純度96.592%;羥甲基糠醛(HMF)對照品購于Dr. Ehrenstorfer Gmbh 公司，批號80606，純度98.7%;甲醇、乙腈為色譜純試劑，水為超純水，其他試劑為分析純;展青霉素分子印跡柱購于R. Biopharm 公司，Oasis HLB 固相萃取小柱(500 mg/6 mL)購于Waters 公司，Mycosep 228 AflaPat 多功能凈化柱購于Romer 公司。

3 批山楂麥曲顆粒(15g/袋)、2 批大山楂顆粒(15 g/袋)樣品購自本地藥店。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm);流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0 ～15 min，4% A;15 ～20 min，4% ～40% A;20 ～25 min，40% A;25 ～30 min，40% ～4% A)，體積流量1.0 mL/min;進樣量50 μL;柱溫35 ℃，檢測波長276 nm。

2.2 樣品制備 將供試品研細，稱取約1 g 置于25 mL 具塞三角瓶中，加入5 mL 1%醋酸溶液，振搖溶解后超聲提取5 min (超聲頻率40 kHz)。依次用2 mL 乙腈、2 mL 水淋洗活化小柱，取上述提取液于已活化的分子印跡柱上，自然重力滴下，分別用1 mL 1%碳酸氫鈉溶液和2 mL 水淋洗，抽真空使柱子干燥，然后加入3 mL 乙酸乙酯溶液洗脫展青霉素，收集洗脫液于氮氣流下40 ℃吹至近干，加入0.1%醋酸溶液溶解殘渣并定容至1 mL，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，供高效液相色譜儀測定。

2.3 對照品溶液的制備 取展青霉素適量用甲醇配制成1 mg/mL 貯備液，置于4 ℃保存，臨用時用0.1%乙酸溶液稀釋成適當質量濃度的對照品溶液。取羥甲基糠醛適量用甲醇配制成1 mg/mL 貯備液，置于4 ℃保存。

2.4 線性關系及檢測限 取展青霉素貯備液適量，配制成一系列質量濃度的對照品溶液，分別進樣進行測定，以化合物峰面積(Y)和對應的質量濃度(X)進行線性回歸，得到展青霉素線性范圍4.83 ～96.59 ng/mL，線性方程Y=0.377X+0.030 6，相關系數r 為0.999 9，線性關系良好。

2.5 回收率試驗 稱取同一批陰性大山楂顆粒樣品9 份，每份約1 g，分別按50、20、5 μg/kg 水平添加展青霉素對照品溶液，每個水平3 份供試品溶液，照“2.2”項方法處理后進樣測定。結果展青霉素回收率在72.9% ～86.0%之間，RSD 在3.3% ～7.1%之間。

表1 展青霉素加標回收率

2.6 檢測限 測定低添加水平回收率供試品溶液的信噪比，按信噪比為3 計算，方法檢測限為3 μg/kg。

2.7 樣品測定結果 應用建立的方法將收集到的3 批山楂麥曲顆粒、2 批大山楂顆粒進行測定，均未檢出展青霉素。

3 討論

3.1 色譜條件優化 流動相的組成及比例對待測組分的峰形、分離度均有影響。實驗中對乙腈-水、四氫呋喃-水、乙腈-磷酸溶液(pH 2.5)等這3 種流動相體系進行了考察，結果四氫呋喃系統、乙腈-磷酸溶液(pH 2.5)系統的分離效果較差，而乙腈-水體系能很好地將展青霉素與雜質峰分離。通過調整流動相比例，當乙腈與水的比例為4 ∶96時，展青霉素出峰時間合適且分離度好。實驗中還比較了Kromasil 100-5 C18、Hypesil ODS2 C18和Agilent XDB C18色譜柱的分離效果，在乙腈-水體系下以Kromasil 100-5 C18柱的分離效果最好，且峰形尖銳，靈敏度高。因此選擇Kromasil 100-5 C18柱為分析柱，4%乙腈為流動相作為色譜分離系統(圖1 ～3)。

圖1 展青霉素對照溶液

圖2 陰性樣品溶液

圖3 加標樣品溶液

羥甲基糠醛是果實中己酮糖在酸性或高溫環境下脫水形成的產物，與展青霉素化學結構相似，表現出相似的色譜行為，因此，羥甲基糠醛成為展青霉素測定時最常見、最易混淆的干擾物。在上述色譜系統下，將羥甲基糠醛和展青霉素的混合對照液進樣，結果兩者分離良好(圖4)。

圖4 羥甲基糠醛、展青霉素混合溶液

3.2 樣品提取凈化條件的考察 中藥制劑中含有眾多成分，而展青霉素又是痕量存在的，需要采用適當的提取和凈化方式來對樣品進行處理，以便盡可能地減少干擾，提高分析靈敏度。由于顆粒劑中含有大量的糖分，若提取溶劑量少則提取溶液黏稠，不易通過凈化小柱，反之溶劑量過大則增加凈化時間。通過比較，確定加入5 mL 提取液時，溶液黏度適中，過柱耗費時間合適。超聲提取時間影響提取效率，實驗中考察了提取時間分別為2、5、10 min的提取回收率，在5 min 時，提取回收率已經達到最大，增加超聲時間，回收率并未顯著增大。因此將提取溶劑體積定為5 mL，超聲提取時間為5 min。

實驗中比較了常用于展青霉素凈化的幾種小柱的凈化效果:Oasis HLB 柱，mycosep 228 AflaPat 多功能凈化小柱和展青霉素分子印跡柱。結果表明Oasis HLB 柱，mycosep 228 Aflapat 多功能凈化小柱的凈化效果不能滿足要求，有雜質峰干擾展青霉素的測定，經過更換流動相組成及比例均難以將雜質與展青霉素分開，而采用展青霉素分子印跡柱凈化后的供試液無雜質干擾，基線平穩，可準確地分析展青霉素，因此選擇分子印跡柱作為凈化方式。

實驗中考察了在分子印跡柱上不同的洗脫溶劑 (乙醚、乙腈、甲醇、乙酸乙酯)對加標樣品的洗脫效果，結果表明乙酸乙酯的平均回收率最高，為77.1%，甲醇和乙醚的平均回收率分別為52.3%、40.5%，乙腈洗脫溶液中有干擾峰，未能計算回收率。比較之下乙酸乙酯洗脫色譜圖雜質干擾峰少，回收率較高，洗脫效果好，因此，選擇乙酸乙酯作為洗脫液。

本實驗建立了山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒中展青霉素的高效液相色譜檢測方法，采用展青霉素分子印跡固相親和柱對提取液進行凈化可很好地去除干擾物，提高分析方法的專屬性。該方法操作簡便、快速、靈敏度高，回收率好，適用于中藥制劑的展青霉素的測定。

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