山楂葉總黃酮對2 型糖尿病大鼠腎臟IGF-1 和IGFBP-3 表達的影響

趙曉蓮， 齊淑芳* ， 張 波， 楊馨妍， 張丹鳳

(1. 佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007;2. 佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154000)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)最常見、最嚴重的慢性微血管并發癥之一，其進展速度約為其他類型腎病的14 倍，若不給予適當治療，常在5 ～10 年內發展至終末期腎功能衰竭而死亡。因此，探討糖尿病腎病的發病機制進而尋求有效的治療手段一直是糖尿病研究領域的重要課題。山楂葉總黃酮(Hawthorn Leaves Flavonoids)具有廣泛的藥理作用，如強心、降血壓、增加冠脈流量、降糖、調血脂、抗脂質過氧化、抑制或清除自由基、抗腫瘤、抗疲勞等［1］。近年來，山楂葉總黃酮在降血糖、調血脂、抗腦缺血等研究方面取得了重大進展，但有關其對糖尿病腎病的影響及機制的研究較少，尤其對糖尿病腎臟IGF-1 及IGFBP-3 影響的研究國內外尚未見報道。本研究通過復制2 型糖尿病腎病大鼠模型，給予山楂葉總黃酮干預治療后，觀察大鼠腎臟IGF-1、IGFBP-3 的表達情況，從不同的角度探討山楂葉總黃酮對2 型糖尿病腎病的治療作用及可能機制，為糖尿病腎病的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康Wistar 大鼠46 只，清潔級，3 ～4 月齡，體質量(220 ±20)克，雌雄各半，由黑龍江省佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 山楂葉總黃酮:臨沂愛康藥業有限公司(批號423706，純度90% );中效胰島素注射劑(賽諾菲-安萬特公司批號11041410);鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司);RT-PCR 試劑盒及相關輔助試劑(大連寶生物工程有限公司);引物合成(上海生工生物工程有限公司)。PCR 儀、凝膠成像分析系統、血糖儀。

1.3 模型制備及分組 46 只健康大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為兩組:正常對照組10 只和糖尿病模型組36 只。將36 只2 型糖尿病組大鼠給予高脂高糖飲食喂養4 周后，禁食16 h (自由飲水)，按50 mg/kg 一次性腹腔注射STZ注射劑，繼續高脂高糖飲食4 周。正常對照組大鼠，給予基礎飼料飲食，4 周后注射等體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。各組大鼠于實驗9 周后尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)、留尿測24 h 尿蛋白。2 型糖尿病腎病組以空腹血糖≥16.8 mmol/L 且出現蛋白尿者為2 型糖尿病腎病大鼠造模成功［2］。將篩選后造模成功的30 只2 型糖尿病腎病大鼠隨機分為3 組:STZ 糖尿病腎病模型對照組、山楂葉總黃酮組、胰島素治療對照組，每組10 只，繼續給予高脂高糖飼養的同時，山楂葉總黃酮組給予山楂葉總黃酮200 mg/(kg·d)(依據前期預實驗結果設定)，灌胃;正常對照組及STZ-糖尿病腎病組給予等量蒸餾水灌胃;胰島素治療對照組每天6 pm 給予中效胰島素1 ～2 U 皮下注射。藥物干預12 周后，所有大鼠稱定質量、測24 h 尿蛋白、內眥靜脈取血、取材后處死。

1.4 指標測定

1.4.1 全自動生化儀檢測血脂、肌酐 (BCr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白(Upr)等生化指標。采用血糖儀測定血糖。

1.4.2 腎組織形態學觀察 各組大鼠腎組織甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋、切片(片厚4 μm)后，HE 染色及PAS染色，光鏡下觀察。對PAS 染色切片進行分析。每張切片隨機取20 個完整的腎小球，計算腎小球細胞外基質(ECM)的相對面積。

1.4.3 RT-PCR 法檢測腎組織IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表達 按Trizol 法試劑盒操作提取腎皮質總RNA;按RT-PCR試劑盒說明操作合成cDNA;PCR 反應擴增DNA (各引物序列及擴增條件見表1)。用凝膠圖像成像分析系統拍攝并分析結果，以目的基因與β-actin 吸光度的比值表示其相對含有量。

1.5 統計學分析 所有實驗數據采用SPSS 18.0 統計軟件處理，數據以±s 表示;組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗，以P ＜0.05 為有統計學意義;指標之間的相關性分析采用t 檢驗。

2 結果

2.1 山楂葉總黃酮對血糖、血脂的影響 模型組大鼠血糖明顯升高，血脂代謝紊亂，經山楂葉總黃酮治療后血糖下降，血脂代謝紊亂明顯改善，與治療對照組比較無統計學意義(見表2)。

表1 引物序列及擴增條件

表2 山楂葉總黃酮對血糖、血脂的影響(±s，n=8)(mmol/L)

表2 山楂葉總黃酮對血糖、血脂的影響(±s，n=8)(mmol/L)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01

組別 血糖 甘油三酯 總膽固醇 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白正常組 9.501 ±2.221 0.689 ±0.101 1.498 ±0.190 0.231 ±0.034 2.578 ±0.251模型組 22.346 ±4.428＊＊ 2.560 ±0.205＊＊ 4.682 ±0.300＊＊ 0.755 ±0.043＊＊ 1.618 ±0.178＊＊陽性組 8.933 ±2.996## 0.785 ±0.126## 1.635 ±0.175## 0.259 ±0.022## 2.448 ±0.192##山楂葉總黃酮組 11.061 ±3.603## 0.876 ±0.133## 1.785 ±0.192## 0.268 ±0.030## 2.263 ±0.205*##

2.2 山楂葉總黃酮對腎功能及腎組織結構的影響 模型組大鼠尿蛋白明顯升高，腎臟功能明顯降低。而山楂葉總黃酮能顯著降低尿蛋白，改善腎功能，其效果與胰島素治療組無明顯差異。

HE 及PAS 染色后，鏡下可見正常組大鼠腎小球、腎小管形態結構完整，腎小球毛細血管基底膜、系膜、基質未見明顯異常，腎小管形狀規則，未見肥大。模型組大鼠腎小球系膜細胞增生，部分腎小球硬化，腎小管上皮細胞腫脹、壞死，腎小球系膜區增寬，系膜基質明顯增多，基底膜增厚，正常腎小管減少，擴張腎小管增加，病理改變明顯。各治療組較模型組均有不同程度改善，且山楂葉總黃酮組與治療對照組比較腎小球細胞外基質的相對面積無明顯差異(見表3)。

表3 山楂葉總黃酮對腎功能、ECM 的影響(±s，n=8)

表3 山楂葉總黃酮對腎功能、ECM 的影響(±s，n=8)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01

組別 24 h 尿蛋白/(mg·24 h -1) 血肌酐/(μmol·L -1) 尿素氮/(mmol·L -1)ECM正常組 10.953 ±1.421 55.592 ±10.556 10.659 ±1.333 0.038 ±0.011模型組 34.802 ±2.815＊＊ 116.523 ±12.688＊＊ 21.224 ±1.695＊＊ 0.120 ±0.015＊＊陽性組 13.002 ±1.365* ## 62.355 ±7.862## 11.588 ±1.100## 0.062 ±0.006＊＊##山楂葉總黃酮組 14.045 ±1.550* ## 69.348 ±9.900* ## 11.532 ±1.008## 0.056 ±0.007＊＊##

2.3 山楂葉總黃酮對腎組織中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達的影響 正常組大鼠腎組織中均可見IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表達，模型組的表達明顯增加。經山楂葉總黃酮治療后大鼠腎組織IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表達均明顯減少且兩者成正相關(P ＜0.01，r =0.994)。山楂葉總黃酮組與治療對照組比較無統計學意義(見表4 及圖1、2)。

3 討論

GH/IGF-1 軸是由GH、IGF-1、IGF-1R 及IGFBPs 組成的復雜系統，該軸系統保持動態平衡對機體組織的分化、增殖及物質代謝具有極其重要的調節作用［3］。大量動物、臨床實驗表明［4-5］，糖尿病患者體內存在GH/IGF-1 軸系統的紊亂，這種紊亂不僅加劇糖尿病患者的高血糖，而且可促進糖尿病慢性并發癥如糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、糖尿病神經病變的發生、發展。近年來的研究證實，腎臟局部GH/IGF-I 的紊亂參與了糖尿病腎病的發生、發展。其中，IGF-1 及IGFBP-3 在2 型糖尿病腎病早期發病中的作用已引起臨床醫師的重視。

表4 山楂葉總黃酮對腎組織中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達的影響(±s，n=8)

表4 山楂葉總黃酮對腎組織中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達的影響(±s，n=8)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01

組別 (IGF-1/β-actin) (IGFBP-3/β-actin)0.387 ±0.016 0.296 ±0.020模型組 0.640 ±0.013＊＊ 0.403 ±0.009＊＊陽性組 0.406 ±0.015* ## 0.334 ±0.016＊＊##山楂葉總黃酮組 0.412 ±0.021* ## 0.345 ±0.021＊＊##正常組

圖1 IGF-1 mRNA 的表達

圖2 IGFBP-3 mRNA 的表達

IGF-1 普遍存在于哺乳動物的組織中，大部分IGF-1 與IGFBPs 結合，以非游離狀態存在，而只有少部分游離的IGF-1 不與任何IGFBP 結合，可以與其受體IGF-1R 結合，發揮其促進細胞生長、抑制細胞凋亡的生物活性。正常生理條件下，IGF-1 系統不能導致腎組織損害，只有在機體損傷，如在糖尿病條件下，才會導致細胞增殖［6］。糖尿病腎病早期出現的腎臟肥大、腎小球高濾過、腎小球系膜細胞增生及ECM 聚積與IGF-1 密切相關，其過度表達對糖尿病腎病的發生具有始動作用。

糖尿病腎病時腎組織中IGF-1 表達增高的原因可能為:①高血糖導致缺氧，引起機體氧化還原系統紊亂，進而引發蛋白激酶C 的失活，最終導致IGF-1 的生成增多［7］;②高糖可使腎小球系膜細胞IGF-1 表達增加;③高糖可使腎臟成纖維細胞IGF-1 表達上調［8］;④有學者［9］報道，在糖尿病腎病發病過程中，由于外周循環血中IGF-1 的增加導致腎臟IGF-1 積聚，但腎臟本身IGF-1 mRNA 的表達并不增加，其原因可能與IGFBPs 表達有關;⑤有學者［10］研究認為，糖尿病腎病的腎小球系膜損傷引起腎臟局部IGF-1 的旁分泌合成代償性增多，同時其降解減少，最終導致IGF-1 水平增高;⑥糖尿病腎病時，伴隨腎臟IGF-1 表達的增加，IGFBP-3 表達也增加，提示IGFBP-3 可能通過調節腎臟局部IGF-1 的自分泌和(或)旁分泌，導致腎臟IGF-1 合成增加。

腎臟IGF-1 的過度表達導致糖尿病腎病的發生、發展，其機制為［11］:①IGF-1 能使系膜細胞增殖引起腎臟增大;②高糖條件下，IGF-1 可促進系膜細胞分泌大量NO，導致腎小球入球小動脈擴張，從而引起GFR 增加;③IGF-1 可引起脂質沉積，形成泡沫細胞，損害系膜細胞功能;④IGF-1 通過誘導系膜細胞產生大量的纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅳ和層黏蛋白，促進細胞的進一步增生和基質的進一步增多，從而對系膜細胞產生持久作用，最終導致腎小球硬化;⑤IGF-1 通過誘導腎臟激肽釋放酶-激肽系統和腎素釋放增加，從而改變腎小球的血流動力學;⑥IGF-1 可持續降低金屬蛋白酶2 的活性，從而使系膜膠原蛋白降解減少，ECM 堆積，導致腎小球硬化。

機體各種組織幾乎均可合成、分泌IGFBPs，這些結合蛋白質作為生物應答的緩沖劑，具有重要的生物學意義。迄今已發現6 種IGFBPs (IGFBP1-6)，其中IGFBP-3 是人體中數量最多，作用最強的結合蛋白，其通過與IGF-1 結合而阻止IGF-1 降解，延長其半衰期，從而調節IGF-1 的生物學有效性和生物學活性。

本實驗采用RT-PCR 和免疫組化的方法研究了STZ-糖尿病腎病大鼠腎組織IGF-1 和IGFBP-3 的mRNA 水平的表達。結果顯示，模型組大鼠IGF-1 和IGFBP-3 在腎小球、近曲小管、遠曲小管和集合管中的表達均較正常組明顯增加。提示糖尿病腎病早期腎臟IGF-1 和IGFBP-3 的異常表達參與了糖尿病腎病的發生、發展。結果也顯示IGF-1、IGFBP-3 呈顯著正相關，說明IGF-1 水平與IGFBP-3 有關，提示IGFBP-3 可能調節IGF-1 在腎組織中的水平。同時也說明在導致糖尿病腎病的過程中，IGF-1 與IGFBP-3 可能有協同作用。

山楂葉總黃酮是山楂葉中黃酮類化合物的總稱，也是山楂葉生理活性的主要成分，具有降糖、調脂、抗氧化、改善心臟功能等多種功效，尤其在心腦血管疾病方面的防治作用以及調血脂、抗衰老等作用，使之愈來愈受到廣大醫藥工作者的關注。本實驗結果顯示，山楂葉總黃酮能明顯降血糖、調血脂，下調IGF-1 和IGFBP-3 的表達，改善腎臟功能。高血糖、IGFBP-3 的表達增多、糖尿病腎病時的腎小球系膜損傷等因素都可以明顯增加腎臟IGF-1 的水平，進而導致糖尿病腎病的發生。山楂葉總黃酮可通過下調IGF-1 及IGFBP-3 的表達，減緩糖尿病腎病的發生、發展。其機制可能為:①通過降糖作用改善氧化還原系統功能，減少機體IGF-1 的過度合成;②通過降糖作用抑制腎臟成纖維細胞和腎小球系膜細胞IGF-1 的高表達;③通過降糖作用抑制系膜細胞分泌大量的NO，改善腎小球血流動力學變化，減輕腎小球的髙濾過;④通過減輕腎小球系膜損傷，從而抑制腎臟局部代償性合成IGF-1 并恢復其降解功能，使IGF-1 水平下降;⑤通過降低IGFBP-3 的表達，抑制由IGFBP-3 刺激腎臟局部合成IGF-1 的增多。但山楂葉總黃酮能下調IGFBP-3 表達的機制還有待進一步研究。

總之，盡管糖尿病腎病的發病機制尚未完全明了，但IGF-1 和IGFBP-3 在STZ-糖尿病腎病腎組織中的蓄積無疑會導致糖尿病腎病的發生。因此，有效調控IGF-1 及IGFBP-3 的表達，為防治糖尿病腎病提供了新的思路。山楂葉總黃酮可通過降糖、調脂、下調IGFBP-3 水平等作用，降低IGF-1 的表達，從而改善STZ-糖尿病腎病的腎功能減退，但其作用機制有待進一步完善。

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