中藥多糖定量測定方法的探討

郭志燁， 韓 麗* ， 楊 明，2* ， 劉李梅， 鄒文銓

(1. 成都中醫藥大學 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都611137;2. 江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004;3. 四川大學，四川成都610064)

1 引言

20 世紀60 年代，多糖作為光譜免疫促進劑引起人們極大興趣［1］。經過幾十年的研究發現從植物中提取的多糖參與了生物體中細胞的多種活動，具有非常重要與特殊的生理活性，如免疫促進、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老等［2］。其中人參多糖、枸杞多糖、靈芝多糖等都已被證明有顯著的藥效且無細胞毒性［3-8］。目前多糖測定方法有比色法(包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等)、滴定法(包括間接碘量法等)、高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層掃描法、高效毛細管電泳法等，以前3 種方法最為常用。檢索《中國藥典》2010 年版發現有8 種藥材收錄了多糖測定方法，即玉竹、云芝、枸杞子、鐵皮石斛、黃精、金櫻子、靈芝、蜂蜜。本文擬通過對較常用的前7 種藥材(除蜂蜜外)定量測定方法的分析，探討藥典中多糖測定方法存在的問題以及解決方法，以期為更多種中藥多糖的定量測定方法的選擇提供依據。

2 玉竹等7 味藥材多糖性質及《中國藥典》中定量測定方法的分析

對7 種藥材的多糖性質和收錄于《中國藥典》中的定量測定方法總結結果見表1。

表1 多糖性質與測定方法總結

多糖按單糖的組成可分為均多糖和雜多糖［9］。已有研究表明玉竹等7 種藥材多糖均為雜多糖［10-18］。由表1 可知此7 種多糖定量測定方法包括苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法和間接碘量法。比色法原理是多糖在硫酸的作用下水解成的單糖分子迅速脫水生成糖醛衍生物，后者能與苯酚或蒽酮縮合成有色化合物，在適當波長下和一定濃度范圍內，該有色化合物的吸光度值與糖濃度呈線性關系，從而可比色測定多糖量［19］。其中苯酚-硫酸法顯色穩定、靈敏度較高、受其他碳水化合物和蛋白質干擾較小，在此3 種方法中應用最為普遍［20-21］。蒽酮-硫酸法簡便、快速，標準曲線的線性、穩定性和重復性均優于苯酚-硫酸法［22-23］。間接碘量法是分別用間接碘量滴定法測定總糖和單糖量，多糖量以無水葡萄糖計，為總糖量減去單糖量，本方法能在一定程度上排除還原性物質的干擾，且快速，不需精密儀器。藥典中隨著藥材的不同選用的多糖提取方法、定量測定方法以及具體操作條件都稍有不同。

3 《中國藥典》中多糖定量測定方法存在的問題

3.1 多糖的提取分離純化問題與雜質干擾問題 《中國藥典》中多糖一般采用熱水提取乙醇除雜，缺少進一步分離純化的步驟，所以得到的多糖中往往含有影響定量測定的雜質如蛋白質、單糖、色素、苷等［2］。單糖類雜質直接與苯酚或蒽酮反應使實測值偏高;蛋白質、苷類雜質在酸性環境中水解后與苯酚或蒽酮反應使實測值偏高［24-25］;色素類雜質使待測樣品本身帶有顏色從而影響測定結果，比如苯酚-硫酸法中顯色物質為橙黃色，如果樣品溶液也為橙黃色，則比色極易受到干擾使實測值偏高［26］。多糖中的雜質會造成其測定結果不準確，而《中國藥典》中在對多糖進行定量測定之前并沒有提到雜質和純度檢查。

3.2 設備問題 傳統比色法的檢測設備分光光度計每次至多能測3 個樣品，存在操作繁瑣、費時費事、可比性與重復性差等缺陷，當待測多糖樣品較多時缺陷尤為明顯［27］。

3.3 測定值與真實值之間存在偏差的問題 此7 種藥材多糖均為雜多糖，由不同的單糖縮合而成。在比色法中相同濃度的不同單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等所做出的標準曲線是不重合的，即同一樣品用不同的標準溶液測得的含量值是不同的［28-29］。在間接碘量法中相同體積的碘滴定液相當于不同單糖的量是不同的，即同一樣品以不同單糖計算所得含有量值也是不同的。所以對于雜多糖而言，測定值與真實值之間總是有差別的。

4 解決思路及方法

4.1 多糖的提取分離純化問題與雜質干擾問題的解決 對于還原性雜質的干擾一般通過先分別測定總糖和單糖，再用總糖量減去單糖量的方法排除，但是這種方法不能從根本上解決雜質干擾問題。因為此問題產生的主要原因是提取分離純化方法過于簡單，不能除去多糖中的雜質。要達到多糖定量測定結果準確的目的，需要做好多糖的提取分離純化、雜質檢查、純度鑒別的前期工作，在得到無雜質純度高的多糖的基礎上再依據其特點選擇不同的定量測定方法。大部分中藥多糖在提取前首先應經過預處理，即除脂溶性成分、單糖、色素等雜質，然后采用熱水回流法得到提取液，再對提取液進行除蛋白處理，最后經過一定體積分數的乙醇沉淀即得到精制粗多糖(多糖類復合物)［30］。當定量測定要求不高時，精制粗多糖可以直接通過酸水解后用比色法進行測定;當定量測定要求較高時，精制粗多糖需經過分級沉淀、柱色譜、透析等方法分離純化后獲得純多糖［31］。無論是精制粗多糖還是純多糖，按單糖的組成都可分為均多糖和雜多糖，中藥多糖普遍為雜多糖。在進行定量測定之前，對于粗多糖，需經過雜質檢查。對于純多糖，除了雜質檢查外還需進行純度檢查及相對分子質量測定［32］。

4.2 設備問題和測量值與真實值偏差問題的解決 蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法測定多糖量已應用多年。在測定復雜的糖類化合物時，雖然存在以上問題，但這兩種經典方法仍有其簡便且較為準確的特點。測定時可以本著簡便、易行、準確的原則，根據待測多糖性質以及實驗條件對傳統比色法進行改良，從而解決多糖定量測定中存在的問題。此外高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等方法中精密儀器的應用也能提高中藥多糖測定的準確性。

4.2.1 改良比色法

4.2.1.1 實驗設備的改良 對于設備問題可以尋找一種與分光光度計原理相同但是分析效率更高的儀器來代替。滿足此要求的是酶標儀，酶標儀與分光光度計均是采用光譜學朗伯-比耳定律，測定的都是樣品的吸光度，但是前者具有高通量檢測分析即一次性上樣量能達到數十至數百個樣品的優勢，可保證各待測樣品測定條件的一致性［33］。楊定清等［34］利用酶標儀實現了快速、可比性與重復性較好的香菇多糖定量測定。趙艷等［35］利用酶標儀測定6 種食用菌中多糖量，實驗結果表明酶標法具有良好的線性范圍，較高的穩定性、可重復性和精密度，可以完全代替紫外可見分光光度計用于多糖的測定，同時使實驗更為快捷、簡便、節約。

4.2.1.2 單糖組分比例明確且簡單的雜多糖定量測定方法的改良 檢測設備的改進能在一定程度上提高多糖定量測定的準確性，但仍然不能從根本上解決傳統比色法的不足即雜多糖以葡萄糖作對照品計算造成的偏差。隨著研究的深入，目前大部分雜多糖通過前期的單糖組分研究能明確單糖組成比，針對此類多糖，可以用相應的單糖按組成比配制成混合標準溶液來代替葡萄糖做標準曲線。林穎等［28］研究表明對于牛膝多糖等雜多糖，以某種單糖(如葡萄糖)為標準，測定值總與真實值有差別。而以接近其實際單糖組成比配制成的混合標準溶液來進行測定，所得結果既符合事實又有較好的重復性。

4.2.1.3 單糖組分比例明確但復雜的雜多糖定量測定方法的改良 中藥多糖種類繁多，同樣是雜多糖，有些多糖由少數幾種比例明確的單糖聚合而成，其定量測定可參照“4.2.1.2”項下，而有些雜多糖中單糖組分比例明確但是種類較多。對于后者配制混合標準溶液較繁瑣且容易產生人為誤差，可以借鑒董群等［36］的研究，分別用各種單糖對照品做標準曲線，得到斜率ki，由此計算各種單糖的校正系數k'i，即它們對葡萄糖的相對斜率，然后用下式計算該多糖校正系數，k' = ∑ik'i× awi，其中awi為組成單糖i 的質量百分數。應用此系數就可以以葡萄糖為標準測定組成已知的雜多糖量，并得到正確結果。

4.2.1.4 單糖組分不明確的雜多糖定量測定方法的改良混合單糖標準溶液的配制和校正系數的計算都能提高多糖定量測定的準確性，但是操作較繁瑣且要求多糖中單糖組成比明確，當所測多糖前期研究基礎較為薄弱，單糖組成比不清楚時“4.2.1.2”、“4.2.1.3”項下改良比色法都不能應用。對此問題的解決，既要遵循對照品與待測樣品結構一致的原則，也要考慮多糖成分結構復雜的事實。鑒于此兩點，可用待測多糖的精制多糖做對照品或者以其對葡萄糖計算換算因子后以葡萄糖做對照品，一方面能避免單純用葡萄糖做標準引起的系統誤差，另一方面較之用與雜多糖組成相同的混合單糖制作標準曲線或據雜多糖組成計算校正系數簡便，而且由于組成上與待測樣品最接近，結果較真實［37-38］。此法也是目前研究中較多用的改良比色法。徐麗媛等［39］研究表明以精制多糖計算粗多糖對葡萄糖的換算因子，校正以往單獨以葡萄糖為對照測定多糖量的方法，使測定結果更為準確可靠。

4.2.2 高效液相色譜法 改良比色法能在一定程度上提高多糖定量測定的準確性，但是仍存在穩定性和選擇性較差的問題，且對儀器的靈敏度和操作者的實驗技能要求較高［40］。國外自20 世紀70 年代以來，開始應用凝膠排斥色譜測定蛋白質等高分子有機化合物，隨著耐高壓填料的出現，高效凝膠排斥色譜法已逐步應用在多糖定量測定上。HPLC 法不僅可以測定總的多糖類復合物的量，也能對某個具有特定相對分子質量的組分進行測定［41-42］，所以在實驗條件允許的情況下，采用此法代替比色法，能解決多糖定量測定方法中存在的問題。

4.2.2.1 應用于單糖組分比例明確的雜多糖的定量測定此法與比色法類似，都是以單糖為對照品，對多糖酸水解后進行測定。但是因為HPLC 法具有靈敏度高、重復性好等優點，使得多糖的定量測定更準確。最近幾年的多糖HPLC 研究中普遍采用此法，如Yang 等［43］以5 種單糖為對照品，對水解后的靈芝多糖用HPLC 法進行測定，結果表明該法簡單、快速、靈敏高、重復性好，可用于靈芝多糖組成分析和定量測定。

4.2.2.2 應用于相對分子質量已知的特定多糖組分的定量測定 HPLC 法是多糖分離純化以及相對分子質量測定方法中的一種，所以能在粗多糖的基礎上制備出純多糖，并計算出平均相對分子質量。對于此類已知平均相對分子質量的純多糖，應遵循對照品與樣品結構相似(相對分子質量相近)的原則，以與其相對分子質量相同的葡聚糖為對照品，用HPLC 法測定多糖量［44］。韓振泰等［45］選用與靈芝多糖保留時間相近的相對分子質量為104的葡聚糖為對照品，采用HPLC 法對靈芝多糖進行測定，結果表明該方法是一種準確性好、精密度高的靈芝多糖定量測定方法。

同樣被稱為靈芝多糖，同樣應用HPLC 法，但是可以根據其性質的不同選擇以上兩種不同的方法。HPLC 法與其他方法比較具有分離效能高、選擇性強、靈敏度高、使用方便、重復性好等優點，雖然目前沒有錄入《中國藥典》，但是越來越多的研究表明此法應用前景較大，是一種值得推廣采用的方法。比如在新藥研發中，對于以粗多糖為研究對象的新藥，在前期的工作中應將主要多糖進行分離后分別進行藥理實驗，然后在質量控制中可以以其中一個藥效強的多糖組分作為質控指標用HPLC 來檢測。對于以純多糖為研究對象的新藥，由于多糖的相對分子質量與多糖活性有很大關系，在用HPLC 進行定量測定之前，必須用HPLC 測定其相對分子質量及相對分子質量分布［29］。陳蕓蕓等［46］通過用HPLC 法對太子神悅膠囊中多糖的相對分子質量分布進行測定后，選擇相對分子質量與樣品相近的葡聚糖Dextrans T-15 為對照品，用面積歸一化法計算各組分量。結果顯示太子神悅膠囊中相對分子質量為17.0 × 103～27.0 × 103的多糖 (JNTP2)的含有量為(0.805 ±0.01)%，此項研究建立了簡便、快捷、精密度高的色譜方法，較為準確地測定了太子神悅膠囊中多糖的含有量和相對分子質量分布，為制定太子神悅膠囊多糖的質量標準提供依據。

4.2.3 其他方法 多糖定量測定除了上述3 種較常用的方法外，還有氣相色譜法、高效毛細管電泳法、薄層掃描法。隨著科學技術的發展，它們作為新的技術應用于多糖定量測定，并取得了一定的進展［47-50］。但是因為設備少技術難等原因還沒有得到普遍應用，且各自的優缺點和應用范圍也有待進一步研究。

5 結語

隨著中藥多糖研究的深入，其定量測定方法中存在問題的解決迫在眉睫。通過以上分析，發現多糖定量測定的準確性是建立在多糖的提取、分離純化、雜質檢查、純度鑒別、組分分析等一系列前期工作的基礎上的。要想得到準確的多糖測定結果，需要選擇合適的分離純化方法并經過雜質檢查、純度檢查證明是純多糖后，再根據其性質以及實驗條件選擇適宜的定量測定方法。雖然目前部分中藥多糖得到了較系統的研究，但是仍有很多種類的中藥多糖因組成成分較多及結構較復雜，研究尚不充分，這也對其定量測定造成了困難。同時因為多糖是結構性質特殊的大分子物質，它的每一步研究都具有特殊性以及前后關聯性，所以多糖定量測定不是一個獨立的研究內容，應該與其他方面的研究相結合，這也是今后每個研究多糖的工作者應該注意的方面。

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