超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)葛花中異黃酮

王金鳳， 魏 穎， 王 芳， 楊翠燕， 王國(guó)玉， 張 琦， 劉 丹

(中國(guó)人民解放軍第二○八醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130062)

葛花是豆科植物葛根Pueraria lobata (willd.)Ohwi 的干燥花蕾。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載葛花主要用于解酒醒脾，治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔呃吐酸、吐血和腸風(fēng)下血等癥［1］，是最具代表性的解酒藥物。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)葛花的主要有效成分為異黃酮類化合物［2-9］，有抗氧化損傷、降糖、降脂、抗炎、抗過敏、抗腫瘤和防治糖尿病并發(fā)癥等多種生物活性，具有重要的保健和藥用價(jià)值。本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測(cè)葛花中的異黃酮成分，為其開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 村料與方法

1.1 儀器與試劑 LTQ 超高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)，Thermo 公司)，Waters H-class 超高效液相色譜系統(tǒng)，配備電噴霧離子源。CP225D 電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司);葛花(河南廣安堂貿(mào)易有限公司20110817);鳶尾苷和鳶尾苷元對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制 (20050817，20051208);大豆苷、大豆苷元和染料木黃酮對(duì)照品購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純 (美國(guó)Fisher 公司);實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (150 mm× 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水(2 ∶1 ∶2)，體積流量0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)264 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 噴霧電壓4.5 kV，金屬毛細(xì)管溫度250 ℃，鞘氣為N2，體積流量0.45 L/min，輔助氣體為He，體積流量3 L/min，分析條件采用負(fù)離子模式，掃描范圍為m/z 200 ～1 500 Da。

2 樣品溶液的制備

2.1 葛花異黃酮的制備 葛花藥材500 g 制成粗粉，85%乙醇索氏回流提取20 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，參照文獻(xiàn)［10-11］方法采用乙酸乙酯萃取純化，60 ℃真空干燥制得葛花異黃酮。

2.2 葛花異黃酮的酸解 葛花異黃酮500 mg 加入75%乙醇100 mL 溶解后加入濃鹽酸30 mL，搖勻，80 ℃水浴12 h。冷卻后加入氫氧化鈉調(diào)pH 為7.0，減壓回收乙醇，沉淀物加去離子水洗滌3 次，60 ℃真空干燥備用。

2.3 檢測(cè)樣品制備 精密稱取葛花異黃酮酸解前后樣品各2 mg，分別放置于25 mL 量瓶中，加入流動(dòng)相，超聲處理10 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容。用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液用于檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

葛花乙醇提取物，經(jīng)乙酸乙酯萃取得到了純化較好的異黃酮成分。參考文獻(xiàn)［12］以甲醇-乙腈-水(2 ∶1 ∶2)為流動(dòng)相，樣品中異黃酮成分分離度較好，基線平穩(wěn)，分離效果理想，有7 個(gè)主要的色譜峰得到較好的分離，如圖1 示。酸解后峰1、2 消失，峰3 明顯縮小，峰4、5、7 升高，推測(cè)前者為后者的糖苷。由于葛花的主要化學(xué)成分為異黃酮類化合物，用負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)所得的總離子流圖有較好的信噪比，對(duì)應(yīng)化合物的質(zhì)譜圖都呈現(xiàn)出很強(qiáng)的［M-H］-準(zhǔn)離子峰，見圖2。通過與對(duì)照品保留時(shí)間、質(zhì)譜信息進(jìn)行對(duì)比，峰1、3、4、6 和7 得到了確證。其準(zhǔn)分子離子峰［M-H］分別為:m/z 415、461、253、269、299，表明其相對(duì)分子質(zhì)量分別為416、462、254、270 和300，通過與對(duì)照品對(duì)比并參考文獻(xiàn)報(bào)道［13-14］，確定為大豆苷 (daidzin)、鳶尾苷 (tectoridin)、大豆苷元(daidzein)、染料木黃酮(genistin)和鳶尾苷元(tectorigenin);峰2 和5 的［M-H］-準(zhǔn)離子峰分別是445 和283，表明其相對(duì)分子質(zhì)量為446 和284，峰2 酸解后可轉(zhuǎn)化為峰5，表明其為峰5 的糖苷，根據(jù)文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道推測(cè)其為印度黃檀苷(sissotrin)和雞豆黃素(biochanin A)。見表1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms

表1 葛花異黃酮HPLC-MS/MS 結(jié)果Tab.1 HPLC-MS/MS results of Pueraria lobata isoflavone

4 結(jié)論

圖2 葛花異黃酮的質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatograms of Pueraria lobata isoflavone

葛花異黃酮具有多種生物活性，市場(chǎng)前景廣闊。本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-MS/MS 對(duì)葛花提取物進(jìn)行分析，研究了其乙醇提取、乙酸乙酯純化后的化學(xué)成分，通過HPLC 分離得到了7 個(gè)化合物，均為異黃酮成分。經(jīng)酸解得到4 個(gè)異黃酮苷元。本研究顯示UPLC-MS/MS 能快速分析鑒定葛花提取物的異黃酮成分，具有快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)，可以作為葛花異黃酮鑒定的有效方法。

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