丹紅注射液中丹酚酸B 在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

唐進(jìn)法， 宋云香， 魯 靜， 李學(xué)林

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州450000)

丹紅注射液是由丹參、紅花兩味中藥按科學(xué)配方提取，制成的中藥復(fù)方制劑，能夠明顯緩解心絞痛癥狀，改善心肌缺血情況，臨床上主要用于治療肺心病、冠心病、心絞痛、慢性腦供血不足等疾病［1］。丹酚酸B 是丹參中的主要酚酸類(lèi)成分，具有保護(hù)心腦血管缺血-再灌注損傷、抗纖維化、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化等作用［2-5］。測(cè)定不同種屬動(dòng)物血漿中丹酚酸B 的方法均有所報(bào)道［6-11］。王小平等［12-13］采用HPLC-MS 法測(cè)定了大鼠靜脈注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸B 的質(zhì)量濃度，但所需儀器昂貴，分析時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定大鼠血漿中丹酚酸B 的超高效液相色譜(UPLC)法，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，適用于大鼠靜脈注射丹紅注射液后丹酚酸B 藥代動(dòng)力學(xué)行為的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 H-CLASS 超高效液相色譜儀(美國(guó)waters 公司);電子分析天平 (德國(guó)賽多利斯)，TGL-16B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))，QL-901漩渦混合器 (海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，BF-2000 氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)12031018)，丹酚酸B (純度大于98.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，111562-201111)，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar 大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量240 ～260 g，雌雄各半，山東魯抗動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK 魯20080002。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 BEH Shield RP18色譜柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，BEH Shield RP18保護(hù)柱(2.1 mm ×5 mm，1.7 μm);流動(dòng)相甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液(29 ∶10 ∶61);體積流量0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備 精密稱(chēng)定丹酚酸B 對(duì)照品3.41 mg，置于10 mL 量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成丹酚酸B 為0.341 mg/mL的對(duì)照品貯備液。取丹酚酸B 對(duì)照品貯備液適量，分別用75% 甲醇稀釋成含丹酚酸B 0.170 5、0.341、0.682、 1.705、 3.410、 6.820、 17.05、34.10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。對(duì)照品貯備液及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4 ℃冰箱保存。

2.3 血漿樣品處理 取血漿200 μL，加入75%甲醇200 μL，2 mol/L 鹽酸溶液100 μL，1%醋酸溶液100 μL，再加入乙酸乙酯1 mL，渦旋1 min，15 000 r/min 離心15 min，吸取有機(jī)層于20 ℃氮?dú)饬飨麓蹈伞埩粑镉?5%甲醇100 μL 溶解，渦旋1 min，15 000 r/min 離心15 min，吸取上清液5 μL 測(cè)定。

2.4 方法學(xué)確證

2.4.1 專(zhuān)屬性 取大鼠空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)方法操作，所得色譜圖見(jiàn)圖1A;將0.170 5 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液加入大鼠空白血漿，除不加75% 甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，所得色譜圖見(jiàn)圖1B;取大鼠尾靜脈給藥2 h 后的血漿樣品200 μL，按“2.3”項(xiàng)方法操作，所得色譜圖見(jiàn)圖1C。結(jié)果顯示，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與最低下限 取空白血漿200 μL，分別加入丹酚酸B 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液200 μL，得到質(zhì)量濃度為0.170 5、0.341 0、0.682 0、1.705、3.410、6.820、17.05 和34.10 μg/mL 的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(W =1/X2)計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。得到丹酚酸B 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y = 34 623.913x+240.466，r=0.992 0。結(jié)果表明，丹酚酸B 在0.170 5 ～31.40 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，定量下限為0.170 5 μg/mL。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿200 μL，分別加入0.341 0、3.410、27.28 μg/mL 的丹酚酸B對(duì)照品溶液，得到高、中、低不同質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度6樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算得到方法準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 空白血漿(A)、空白血漿加入0.170 5 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液(B)、大鼠給藥2 h 后血漿(C)的色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms:A (blank plasma sample);B (blank spiked with 0.170 5 μg/mL standard salvianolic acid B solution );C (rat plasma sample collected 2 h after intrarenous administration)

表1 大鼠血漿中丹酚酸B 的準(zhǔn)確度和精密度Tab.1 Accuracy and precision of salvianolic acid B in rat plasma

2.4.4 回收率測(cè)定 取空白血漿200 μL，分別加入0.341 0、3.410、27.28 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液，得到高、中、低不同質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣分析，另取相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液 (0.341 0、3.410、27.28 μg/mL)，進(jìn) 樣10 μL，將所得峰面積比較，計(jì)算提取回收率分別為(90.0 ±6.4)%、 (90.3 ±4.3)%和(92.1 ±2.5)%。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1 樣品采集及測(cè)定 Wistar 大鼠6 只，雌雄各半，實(shí)施頸靜脈插管手術(shù)，插管后飼養(yǎng)3 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。大鼠以10 mL/kg (含丹酚酸B 0.336 5 mg/mL)的劑量尾靜脈注射丹紅注射液，分別于給藥前及給藥后 0.016 7、0.083 3、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 h經(jīng)導(dǎo)管取血約0.5 mL，置肝素化離心管中，在4 ℃下4 500 r/min 離心15 min，分離血漿，于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

血漿樣品按“2.3”項(xiàng)處理，取上清液分析測(cè)定，將所測(cè)得色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。

2.5.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 大鼠尾靜脈注射丹紅注射液后，丹酚酸B 的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。采用DAS2.1.1 軟件計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 大鼠單劑量靜脈注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸B平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)Fig.2 Mean plasma concentration-time profile of salvianolic acid B after intravenous administration of Danhong Injection to rats

表2 大鼠單劑量靜脈注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸B 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of salvianolic acid B in rats after intravenous administration of Danhong Injection

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期曾嘗試使用甲醇、乙腈等試劑沉淀蛋白來(lái)處理血漿，但所得樣品色譜圖中，內(nèi)源性干擾峰及雜質(zhì)都較多，檢測(cè)靈敏度較差，故改用液液萃取法。考察了中性及酸性(1 moL/L 鹽酸溶液+1%醋酸溶液、2 moL/L 鹽酸溶液+1%醋酸溶液)條件下血漿中丹酚酸B 的提取回收率，確定以2 moL/L 鹽酸溶液和1%醋酸溶液為酸化劑。接著比較了不同提取溶劑(丙酮、乙酸乙酯)對(duì)血漿中丹酚酸B 提取回收率的影響，最終選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

中藥制劑中含有多種化學(xué)成分，成分間可能會(huì)發(fā)生相互作用，使Tmax、Cmax或AUC 等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生改變［9，14］，目前，關(guān)于丹紅注射液中各成分相互協(xié)調(diào)、發(fā)揮綜合協(xié)同作用的研究報(bào)道較少，今后，將多開(kāi)展丹紅注射液中多組分藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

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