載10-羥基喜樹堿超聲微泡的制備、表征及其體外超聲成像特性

李思陽， 孔慶新， 王 洋

(1. 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安223003;2. 東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040)

喜樹堿 (camptothecin，CPT)是1966 年由Wall 等［1］從我國特有珙桐科植物喜樹Camptotheca acuminata Decne 中分離得到的一種吲哚類生物堿［2］，具有良好的抗腫瘤活性［3］。10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin，HCPT)是喜樹堿的純天然微量衍生物［2］，是我國臨床使用的重要抗腫瘤類藥物［4］，但由于不良反應大、生物利用度低限制了其應用［2］。因此，改進劑型、修飾結構、以及研究新型藥物傳遞系統成為關注的熱點［5-6］。

超聲微泡也稱超聲造影劑，是一種含氣體的高分子微泡［7］，超聲微泡作為載藥工具有以下特點:(1)靶向作用［7］;(2)藥物在靶組織中可以維持較高的濃度［7-9］; (3)顯著提高基因轉染率［10］;(4)降低機體免疫反應［7-11］。聚乳酸也稱為聚丙交酯(polylactide)，是一種常見的可生物降解的高分子多聚物成膜材料，具有無毒、化學穩定好、成球性好、生物相容性良好等特性［12］。PLA 載藥微泡具有適用藥物范圍廣，載藥量高，表面易修飾，輔助識別功能等優點［13］。

本研究以聚乳酸為材料，以W/O/W 型乳化溶劑揮發法制備載羥基喜樹堿超聲微泡，以保證其在體內釋放的穩定性，使其達到一種長期平穩緩釋的效果，為進一步的藥代動力學研究提供基礎數據。

1 材料與儀器

1.1 試藥 聚乳酸(PLA)(山東省醫療器械研究所);HCPT (批號081020，純度99%，哈爾濱峰源高科技開發有限公司);其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備 Cary Eclipse 熒光光譜儀(美國Varian 公司);FEI QUANTA 200 掃描電子顯微鏡(美國FEI 公司);FD5505 真空離心濃縮系統(美國SIM 公司);KQ-50 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);LA-920 型激光散射粒度儀(日本HORIBA 公司)。

2 方法與結果

2.1 載羥基喜樹堿超聲微泡的制備 稱取10 mg HCPT、250 mg PLA 于10 mL 二氯甲烷中，磁力攪拌30 min 至溶液完全混勻。取出轉子，加入0.5 mL 4%的(NH4)2CO3溶液，探頭超聲(110 W，30 s)，形成初級W/O 微球。然后將得到的初級微乳緩慢滴加到預冷的25 mL 2% PVA 溶液中，使用高速分散均質機勻化(9 000 r/min，5 min)，形成W/O/W微球。將上述溶液轉移至50 mL 1%的異丙醇溶液中，磁力攪拌4 h，使微球表面逐漸固化，并完全去除二氯甲烷。將得到的乳液5 000 ×g 離心5 min，去上清液。沉淀加入30 mL正己烷洗滌，重復3 次，所得沉淀空氣干燥，除去殘留的正己烷。加3 mL 去離子水于沉淀中，渦旋，使沉淀充分分散后用液氮預凍，于-53 ℃下真空冷凍干燥48 h，將樣品稱定質量后密封低溫避光保存。

2.2 掃描電子顯微鏡觀察 稱取3 mg 凍干粉樣品于離心管中，加入適量去離子水，渦旋，使凍干粉分散均勻，取50 μL 懸濁液于鋁片上，涂抹均勻，噴金后觀察樣品。掃描電鏡圖像在12.5 kV、9.5 mm工作距離的陽離子加速電壓下獲得。其結果見圖1。

圖1 載羥基喜樹堿超聲微泡掃描電鏡圖像Fig.1 SEM image of HCPT-loaded microbubbles

由圖1 可以看出，載羥基喜樹堿超聲微泡呈明顯的球狀結構，表面光滑，粒徑大小在2 μm 左右。有一定的聚集現象，主要是因為在樣品制備的過程中，干燥、噴金等步驟會其有一定的影響，但依然保持著完好的球形結構，證明了其穩定性。此外，在真空冷凍干燥的過程中，由于碳酸銨的揮發，會形成一些表面帶孔狀的微球，這一結構有利于微泡在超聲破碎的過程中將HCPT 釋放出來。

2.3 粒徑分布 粒度的大小及分布是評價超聲微泡性能的重要指標，通過靜態光散射的方法測定空白超聲微泡和載羥基喜樹堿超聲微泡的粒度及分布。結果見圖2。

圖2 結果表明，新型微泡具有多分散性，和空白超聲微泡相比，載羥基喜樹堿超聲微泡的粒徑大小和分布沒有明顯變化，粒度分布比較集中，所有的微泡粒徑都小于6 μm，可以達到臨床使用的安全范圍。粒徑大小在0.45 ～5.12 μm 之間分布，這與掃描電子顯微鏡觀察的結果相吻合。

2.4 包封率和載藥量測定

2.4.1 標準曲線的繪制 稱取HCPT 對照品5.0 mg，于50 mL 量瓶中，用DMSO 定容得0.1 mg/mL 的母液。將母液分別稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL 系列對照品溶液。通過熒光分光光度計［7］檢測HCPT 的激發波長Ex和發射波長Em，確定其激發波長Ex=373 nm，發射波長Em=430 nm，在此條件下測定對照品溶液的吸光度值。以HCPT 的質量濃度為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標，得到標準曲線方程y =1 208.1x +16.022，r2=0.998 5，結果表明HCPT 在0.1 ～0.8 μg/mL 質量濃度范圍內線性關系良好。

圖2 空白微泡(A)和載羥基喜樹堿超聲微泡(B)粒度分布Fig.2 Size distribution of freshly prepared blank microbubbles (A)and HCPT-loaded microbubbles (B)

2.4.2 包封率和載藥量測定 精密稱取5 mg 凍干粉樣品3 份，分別加入4 mL DMSO 使其完全溶解，稀釋300 倍，測定其吸光度值，根據“2.4.1”項標準曲線計算HCPT 量，并根據公式(1)和(2)計算包封率和載藥量。

載羥基喜樹堿超聲微泡的包封率和載藥量分別為(67.44 ±2.55)%、 (4.10 ±1.29)%。結果表明，這種載羥基喜樹堿超聲微泡具有很高的載藥量，能夠實現藥物的有效運載，可以作為載藥系統傳遞HCPT。

2.5 體外釋藥特性研究

2.5.1 HCPT-PBS 標準曲線繪制 精密稱取5 mg HCPT 粉末，用DMSO 定容至50 mL，得到0.1 mg/mL HCPT 母液。母液用PBS 溶液分別稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL 系列對照品溶液。通過熒光分光光度計檢測HCPT 在PBS 中的激發波長Ex=375 nm，發射波長Em=552 nm，在此條件下進行熒光分光光度分析，并繪制標準曲線。以HCPT 質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到標準曲線方程y = 206.54 x + 7.136 7，R2=0.999 1，表明HCPT 在0.1 ～1 μg/mL 質量濃度范圍內線性關系良好。

2.5.2 體外釋放 精密稱取2 mg 凍干粉末樣品于10 mL 離心管中，加入5 mL 去離子水，待渦旋混勻后，吸取1 mL 溶液于透析袋內密封。透析袋置于25 mL PBS (pH=7.4)釋放介質中，37 ℃恒溫培養箱中磁力攪拌，在0.08、0.16、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、10、12、18、24、36、48 h 時間點分別取3 mL 釋放液并補充相同體積的新鮮釋放液。使用熒光分光光度計測定釋放液中HCPT 的吸光度值，通過“2.5.1”項標準曲線計算出釋放液中HCPT 的量，計算出累積釋放率。結果見圖3。

圖3 載羥基喜樹堿超聲微泡體外釋放Fig.3 In vitro release of free HCPT and HCPTloaded microbubbles

從圖3 中可以看出，游離HCPT 釋放較快，約4 h 累積釋放率超過了80%，12 h 后基本釋放完全;載羥基喜樹堿微泡持續緩慢釋放，48 h 后，累積釋放率接近60%，且仍然繼續釋放。這一結果充分證實了載羥基喜樹堿超聲微泡具有連續的釋放特性和明顯的緩釋效果，為下一步的體內釋放試驗提供一定的數據支持。

2.6 體外超聲成像［14］通過體外超聲顯影效果來評價載羥基喜樹堿超聲微泡的超聲成像特性。以醫用級硅膠管作為血管模型，在管中分別注入載羥基喜樹堿超聲微泡和經脫氣處理的蒸餾水，在普通B超模式和脈沖反向諧波模式(PIHI)條件下同時成像，用超聲診斷儀檢測和比較兩者的超聲效果。結果見圖4。

圖4 載羥基喜樹堿超聲微泡體外超聲成像圖Fig.4 In vitro ultrasound images of HCPTloaded microbubbles

從圖像中可以看出，由于管壁密度較大，當推注脫氣水后，在超聲場里回聲較高，但是管腔呈現無回聲狀態(圖4a 和4b)。當推注載羥基喜樹堿超聲微泡之后(圖4c 和4d)，與推注之前相比，硅膠管管腔回聲明顯增強，呈現密集細點狀強回聲，說明了制備的載羥基喜樹堿超聲微泡具有較好的體外超聲特性，可以進行臨床的深入開發與應用。

3 討論

羥基喜樹堿是一種臨床應用非常廣泛的抗癌藥物［15］，已經廣泛引起各國研究者的關注。但是由于其活性內酯環容易開環，往往導致其藥理活性降低。針對該缺陷，眾多學者紛紛通過修飾其活性內酯環的結構或改變羥基喜樹堿的劑型，通過新型載藥系統來傳遞藥物，如脂質體［16］、納米顆粒等形式［17］，這些給藥系統能夠在一定程度上提高藥物的療效，降低其毒副作用。

本課題組研究采用的PLA 具有良好的生物降解性，是獲得美國FDA 批準的可用于注射的藥用輔料之一。以W/O/W 型乳化溶劑揮發法制備載羥基喜樹堿超聲微泡，該超聲微泡粒度分布在0.45 ～5.12 μm 之間，載藥量和包封率分別為(4.10 ±1.29)%和(67.44 ± 2.55)%，體外釋放可持續48 h，累積釋放率達到60%，具有良好的緩釋效果。體外超聲成像顯示該微泡具有良好的反射超聲信號能力，可以作為載藥超聲造影劑進行深入的研究和應用。此外，該研究對于載羥基喜樹堿超聲微泡的藥代動力學研究提供一定的數據支持。

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