艾葉水提物及其發酵物體內外抗陰道毛滴蟲作用

白 靜， 胡 雷， 張 麗， 田春雨， 龐得全， 薄海美， 韓淑英*

(1. 河北聯合大學，河北 唐山063000;2. 唐山市工人醫院，河北 唐山063000)

滴蟲性陰道炎是婦科常見病。目前臨床上常采用甲硝唑治療，但該藥可導致消化、神經、血液、皮膚等系統的不良反應，且有潛在的致癌、致畸、致突變作用［1-2］。此外陰道毛滴蟲對甲硝唑的耐藥性為9.6%［3］。因此尋找更為安全有效的治療藥物是十分必要的。艾葉是我國傳統中藥，為菊科植物艾蒿Artemisi argyi Levl. et Vant. 的干燥葉。具有溫經止血、散寒止痛、調經安胎、除濕止癢、通經活絡等功效［4-5］，現代藥理研究表明其具有鎮痛、抗菌、抗病毒、鎮咳、平喘、祛痰等藥理作用［6-7］。民間常單獨或組成復方制劑用于細菌性或霉菌性陰道炎的治療［8］，對于是否能用于滴蟲性陰道炎的治療未見報道，本實驗利用中藥發酵技術，將艾葉水提物進行生物發酵，將所得艾葉發酵物與水提物進行療效比較，以期獲得更為有效的治療陰道毛滴蟲的藥物。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明小鼠，體質量18 ～22 g，雌性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號SCXK ＜京＞2009-0008。

1.2 受試藥物 艾葉水提物:將艾葉研碎，水浴加熱煮沸2 h 后，4 層紗布過濾，將濾渣繼續浸煮2 h，將兩次濾液合并，濃縮成每100 mL 含生藥100 g。艾葉發酵物:取高壓滅菌后的增殖菌液體培養基(蛋白胨40 g，酵母浸粉20 g，葡萄糖40 g于1 000 mL 蒸餾水中)于無菌容器內，無菌環境下加安琪干酵母10 g/100 mL，置37 ℃恒溫培養箱培養6 h。將活化增殖的酵母菌液加入等體積的上述艾葉水提物、6%蛋白胨、6%葡萄糖，混合均勻后繼續發酵。發酵條件為:培養溫度37 ℃，培養時間72 h。發酵結束后，將發酵物加入無水乙醇，使乙醇終體積分數達到70%，在70 ℃萃取4 h，將提取液離心15 min，2 500 r/min。取上清液在旋轉蒸發儀上回收乙醇，回收乙醇后的剩余液即為醇提后的艾葉發酵物，每1 00 mL 艾葉發酵物含生藥50 g。將上述艾葉水提物也稀釋成50 g 生藥/100 mL。陽性對照藥物甲硝唑氯己定洗劑:每1 mL 含葡萄糖酸氯己定1.2 mg、甲硝唑0.2 mg，深圳佳泰藥業有限公司，批號A110822L。

1.3 試劑 兔肝(河北聯合大學實驗動物中心提供);蛋白胨(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20120206);半胱氨酸鹽酸鹽(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20111012);麥芽糖(汕頭市光華化學廠，批號20100815);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號20100628011);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號X1112407);注射用硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司，批號1110109);苯甲酸雌二醇 (天津必佳藥業集團有限公司，批號20120101)。

1.4 陰道毛滴蟲蟲株來源 陰道毛滴蟲取自河北聯合大學附屬醫院婦科門診并經醫生確診為滴蟲性陰道炎患者的陰道分泌物，轉種3 代后備用。

1.5 儀器 mLS-3750 高壓滅菌器，日本SANYO公司;HR40-IIA2 生物安全柜，青島海爾公司;Coic 倒置顯微鏡XDS-1B，重慶光電儀器有限公司;CO2恒溫培養箱2123TC，美國SHEL-LAB 公司。

2 方法

2.1 體外試驗 取滅菌小試管進行編號，設置艾葉水提物、艾葉發酵物、甲硝唑、空白對照4 個試驗組，藥物組分別設置6 個劑量，分別為1 ∶5，1 ∶10，1 ∶20，1 ∶40，1 ∶80，1 ∶160。1 ∶5 劑量配制方法為2.4 mL 肝浸湯培養液+0.6 mL 受試藥物，從此管中取出1.5 mL 至下一管中，按2 倍稀釋法依次類推進行稀釋，空白組管中加入1.5 mL肝浸湯培養液。每管重復5 次。將轉種第3 代滴蟲用血球計數板計數，用培養液將其密度調至1 ×105個/mL。活蟲比例99%以上，取0.5 mL 滴蟲混懸液加入各試驗管內，置37 ℃恒溫箱內培養4、8、16、24 h 后，于倒置顯微鏡下觀察，記錄活蟲數。其方法為用吸管吸取一滴陰道毛滴蟲懸液(吸前用干凈吸管吹打均勻)，滴入計數板凹槽內，至蓋玻片下被液體充滿為止，2 min 后，在顯微鏡下計數活蟲體數(只計數對角線)對于壓線的蟲體只計數在上線和左線者，對于蟲體團按單個蟲體計數，蟲體變圓、膨脹或收縮，鞭毛和波動膜不活動或輪廓不清、邊緣不整、蟲體裂解、溶解或蟲體內完全顆粒變性者判定為死亡。計算各管活蟲密度。按以下公式計算相對抑制率。相對抑制率=［(空白對照組滴蟲密度-加藥組滴蟲密度)/空白對照組滴蟲密度］× 100%，活蟲數等于或高于接種數視為藥物無效。

2.2 體內試驗 昆明小鼠110 只，每只小鼠背部皮下注射苯甲酸雌二醇0.25 mL，隔天注射一次，連續3 次。于注射次日，除空白對照組外，其余各組用20 μL 微量加樣器吸取密度為1 ×107個/mL蟲體混懸液20 μL 注入小鼠陰道深部。于接種第5天進行陰道分泌物鏡檢，若鏡檢有大量活動陰道毛滴蟲，即確定造模成功。將成模小鼠隨機分為模型對照組、甲硝唑組(0.2 mg/mL)、艾葉水提物組(20 mg 生藥/mL)，艾葉發酵物低、中、高劑量組(10、20、40 mg/mL)，每組15 只。次日除空白及模型組外，其余各組用微量加樣器給予相應藥物50 μL，連續陰道給藥7 d。于給藥第3 天及末次給藥次日(給藥第8 天)用50 μL 無菌生理鹽水反復沖洗陰道，滴入血球計數板凹槽內，記錄活蟲體數。

2.3 陰道組織病理學檢查 于給藥第8 天陰道灌洗后，脫臼處死小鼠，解剖分離出每組小鼠陰道組織，常規石蠟包埋，HE 染色，鏡下觀察病理變化。切片標本鏡下按充血、水腫、出血、浸潤四項基本指標進行評分，無充血、水腫、出血、浸潤評0 分，輕度評1 分，中度評2 分，重度評3 分，分別用“-”、“+”、“+ +”、“+ + +”來表示。評分標準見文獻［9］。

2.4 統計方法 采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，分析方法為重復測量設計方差分析及bonferroni 法。

3 結果與分析

3.1 體外試驗 結果見表1。與艾葉水提物相比，同劑量下艾葉發酵物在4 ～24 h 體外對陰道毛滴蟲抑制率均有顯著差異(P ＜0.01)，艾葉發酵物在1 ∶5及1 ∶10 劑量下24 h 對滴蟲的抑制率達到100%，可殺死全部蟲體，且在1 ∶10 劑量下其作用優于甲硝唑(P ＜0.05);艾葉發酵物同一劑量隨著時間延長，其對蟲體抑制率也有升高趨勢。

表1 不同劑量受試藥物不同時間體外對陰道毛滴蟲抑制率(±s，n=5)Tab.1 Inhibition ratio of tested drugs with various concentrations on trichomonas vaginalis at different times in vitro (±s，n=5)

表1 不同劑量受試藥物不同時間體外對陰道毛滴蟲抑制率(±s，n=5)Tab.1 Inhibition ratio of tested drugs with various concentrations on trichomonas vaginalis at different times in vitro (±s，n=5)

注:同劑量下與艾葉水提物比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;同劑量下與艾葉發酵物比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

藥物 稀釋劑量 藥物不同時間陰道毛滴蟲抑制百分率/%4 h 8 h 16 h 24 h艾葉水 1 ∶5 46.22 ±10.37 46.41 ±7.87 48.81 ±10.82 47.25 ±3.67提物 1 ∶10 35.62 ±11.40 36.86 ±2.25 36.69 ±10.08 38.87 ±4.45 1 ∶20 13.85 ±6.66 15.65 ±5.77 13.25 ±2.86 10.17 ±7.04 1 ∶40 8.29 ±7.26 10.04 ±1.28 12.93 ±7.80 13.00 ±0.00 1 ∶80 2.22 ±0.37 4.41 ±0.87 5.81 ±0.82 7.25 ±0.67 1 ∶160 1.25 ±0.12 1.34 ±0.15 1.28 ±0.65 2.15 ±0.26艾葉發 1 ∶5 96.35 ±4.23 ＊＊ 99.21 ±7.34 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊酵物 1 ∶10 96.26 ±4.14 ＊＊ 97.34 ±3.49 ＊＊ 99.33 ±3.26 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊1 ∶20 76.22 ±10.37 ＊＊ 89.41 ±7.87 ＊＊ 89.81 ±10.82 ＊＊ 90.25 ±3.67 ＊＊1 ∶40 55.62 ±11.40 ＊＊ 56.86 ±2.25 ＊＊ 56.69 ±10.08 ＊＊ 58.87 ±4.45＊＊1 ∶80 32.85 ±6.66 ＊＊ 35.65 ±5.77 ＊＊ 36.25 ±2.86 ＊＊ 38.17 ±7.04 ＊＊1 ∶160 20.29 ±7.26 ＊＊ 24.04 ±1.28 ＊＊ 26.93 ±7.80 ＊＊ 20.00 ±0.00 ＊＊甲硝唑 1 ∶5 97.16 ±2.46 100.0 ±0.00 100.0 ±0.00 100.0 ±0.00 1 ∶10 78.12 ±1.13 # 87.70 ±9.41 # 87.99 ±2.83 # 87.20 ±1.34 #1 ∶20 62.81 ±5.70 # 81.43 ±10.62 89.05 ±3.85 93.12 ±0.99 #1 ∶40 54.51 ±6.86 75.11 ±11.90 78.71 ±4.92 80.05 ±0.95 1 ∶80 35.42 ±6.59 40.33 ±16.03 41.05 ±2.75 41.99 ±3.73 1 ∶160 20.33 ±5.72 21.43 ±12.86 28.88 ±6.15 22.48 ±2.40

3.2 體內試驗 與空白對照組比較，模型對照組小鼠陰道內鏡檢可見大量陰道毛滴蟲。與模型對照組比較，艾葉水提物組和艾葉發酵物不同劑量組在給藥第3 天和第8 天可明顯減少陰道毛滴蟲數量(P ＜0.05，P ＜0.01)，艾葉發酵物組作用更明顯(P ＜0.01)，且隨劑量增大，作用增強。見表2。

3.3 HE 染色陰道組織病理檢查 表3、圖1 結果顯示，模型對照組小鼠陰道組織出現重度充血、水腫，有大量炎細胞浸潤;與模型對照組比較，艾葉水提物組陰道組織病變程度亦較重，艾葉發酵物高劑量組小鼠輕度充血、水腫，少量炎細胞浸潤，其治療效果與甲硝唑相近。

表2 各組小鼠體內陰道毛滴蟲密度(±s，n=15)Tab.2 Concentrations of trichomonas vaginalis in mice in each group (±s，n=15)

表2 各組小鼠體內陰道毛滴蟲密度(±s，n=15)Tab.2 Concentrations of trichomonas vaginalis in mice in each group (±s，n=15)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與艾葉水提物組比較，Δ P ＜0.05，ΔΔP ＜0.01。下表同

組別 劑量/(mg 生藥·mL -1) 給藥第3 天蟲體密度/(×102·mL -1) 給藥第8 天蟲體密度(×102·mL -1)空白對照組-0 0模型對照組 - 232.38 ±23.05＊＊ 341.69 ±36.59＊＊艾葉水提物組 20 165.26 ±13.56# 186.25 ±12.03#艾葉發酵物組 10 12.45 ±0.13##ΔΔ 9.06 ±0.10##ΔΔ艾葉發酵物組 20 0.95 ±0.25##ΔΔ 0.15 ±0.01##ΔΔ艾葉發酵物組 40 0.28 ±0.09##ΔΔ 0.03 ±0.00##ΔΔ甲硝唑組 0.2 0.17 ±0.01##ΔΔ 0.01 ±0.00##ΔΔ

表3 各組小鼠陰道病理組織評分動物數(±s，n=15)Tab.3 Number distribution of vaginal tissue damage scores in each group (±s，n=15)

表3 各組小鼠陰道病理組織評分動物數(±s，n=15)Tab.3 Number distribution of vaginal tissue damage scores in each group (±s，n=15)

組別 劑量/(mg 生藥·mL -1) 0 分 1 分 2 分 3分15 0 0 0模型對照組＊＊ - 0 0 4 11艾葉水提物# 20 0 5 6 4艾葉發酵物低劑量組##ΔΔ 10 5 3 5 2艾葉發酵物中劑量組##ΔΔ 20 10 3 1 1艾葉發酵物高劑量組##ΔΔ 40 13 1 1 0甲硝唑組##ΔΔ空白對照組-0.2 12 2 1 0

圖1 HE 染色各組小鼠陰道組織圖Fig.1 HE staining figures of vaginal tissue of mice

4 討論

艾葉為我國傳統中藥，目前常制作成艾灸用于臨床［10］，傳統工藝制備的艾葉水提物其藥理作用較弱，臨床并未得到廣泛應用。為將艾葉開發成更有價值的新型藥物，本研究采用中藥發酵技術進行中藥炮制，該方法是以中藥為反應底物，通過微生物發酵過程對其結構進行修飾、轉化從而達到提高中藥藥效、降低毒性、促進吸收、改善口味等目的［11-12］。目前該技術已成為一種新型的中藥研究技術，并取得了一定的成績。如用酵母菌發酵大黃，會使大黃總蒽醌、結合性蒽醌量稍有降低，分離型蒽醌的量會增加，從而起到減毒增效的作用［13］。王玉紅等［14］將黃芪加入到靈芝發酵的過程中，使得多糖的成分發生變化，增加了產生新的物質的可能性。

本研究以中藥艾葉為反應底物，通過酵母菌發酵過程對艾葉中成分進行修飾，以期得到更為有效的抗白色念珠菌治療藥物。結果表明在體外試驗中，與艾葉水提物組相比，在相同劑量同一時間下艾葉發酵物組在體外對陰道毛滴蟲的抑制作用相對較強(P ＜0.01)，艾葉發酵物在1 ∶5 及1 ∶10 劑量下24 h對滴蟲的抑制率達到100%，且在1 ∶10劑量下作用優于甲硝唑(P ＜0.05)。在體內試驗中與艾葉水提物比，艾葉發酵物不同劑量組小鼠陰道內陰道毛滴蟲密度明顯減少，于給藥第8 天，中、高劑量作用更為明顯，且陰道組織病理顯示艾葉發酵物中、高劑量組各小鼠陰道組織病變程度明顯減輕。體內外試驗提示艾葉發酵物具有明顯的抗陰道毛滴蟲作用。但艾葉發酵物中何種成分發揮了該作用尚需進一步研究。

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