黑斑蛤蚧對哮喘模型小鼠的免疫調節的影響

廖成成， 臧 寧， 班建東， 唐景財， 何 敏， 李 力

(1. 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧530000;2. 廣西醫科大學醫學科學實驗中心，廣西 南寧530021;3. 廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧530023)

哮喘嚴重危害人類健康，發病人數逐年增加，預防和控制任務艱巨。 《本草綱目》記載蛤蚧(gecko)可用于虛喘氣促，臨床和民間應用均顯示其可用于治療支氣管哮喘［1］。目前普遍認為免疫失調是引發該病的重要原因。本研究通過觀察黑斑蛤蚧對過敏性哮喘小鼠血清中白介素4(IL-4)、白介素5 (IL-5)以及干擾素γ (IFN-γ)的影響，探討蛤蚧對BALB/c 哮喘模型小鼠的治療作用，進一步為黑斑蛤蚧的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 4 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心(實驗動物合格證號:0046242)，10 只1 籠，繼續喂養至體質量25 ～30 g。

1.2 試劑與藥物 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)購自Sigma 公司;氫氧化鋁(上海生化試劑廠);地塞米松(天津天藥藥業股份有限公司);生理鹽水(廣西醫科大學制藥廠);ELISA 試劑盒(上海西塘生物科技有限公司);黑斑蛤蚧粉由廣西藥用植物園提供，產地為廣西大新縣寶圩鄉。蛤蚧除去內臟，60 ℃置烘箱內烘干，粉碎成粉末。

1.3 儀器 酶標儀為BioRad 公司的iMark680，超聲霧化器(402B)為江蘇魚躍醫療設備股份有限公司產品;自制小鼠霧化吸入箱材料為塑料，尺寸為(55 cm×35 cm ×30 cm)。

1.4 方法

1.4.1 哮喘模型的制備 50 只BALB/c 小鼠，10只為正常對照，不參與建模，其余40 只參照參考文獻［2-6］方法，小鼠分別于第1、第7 和第14天腹腔注射200 μL 內含10 μg OVA、40 mg 氫氧化鋁的生理鹽水致敏。第15 天開始將上述小鼠一起置于霧化箱中，以1%OVA 生理鹽水霧化激發。霧化器動力為1.7 MHz，霧化率為2 mL/min，每天1次，每次30 min，共激發14 d。觀察小鼠是否出現煩躁、呼吸急促、哮鳴音、腹肌抽搐及口唇紫紺等癥狀，參與建模的小鼠均出現不同程度的上述癥狀，說明建模成功。

1.4.2 動物分組與給藥 50 只BALB/c 小鼠隨機分為10 只正常對照組及40 只哮喘模型組。建模成功的哮喘模型組被隨機分為3 組:黑點蛤蚧干預組、地塞米松干預組、生理鹽水組，每組10 只。最后一次致敏后第2 天開始給藥，黑斑蛤蚧組小鼠給藥劑量為1 g/kg，6 g 黑斑蛤蚧干粉加100 mL 生理鹽水調和，每只小鼠(按30 g 體質量)0.5 mL灌胃給藥。地塞米松組給藥劑量為0.20 mg/mL，每只小鼠(按30 g 體質量)0.5 mL 灌胃給藥。生理鹽水組及正常對照組均以生理鹽水0.5 mL 灌胃給藥。各組連續給藥7 d。

1.4.3 血清樣本制備 給藥結束后第2 天，3 組小鼠摘除眼球取血，室溫靜置1 h;于40 ℃，1 500 r/min 離心10 min，吸取血清，分裝后凍存于-20 ℃。

1.4.4 血清中IL-5、IL-4、IFN-γ 的測定 采用ELISA 雙抗體夾心法測定，按試劑盒操作說明書進行檢測。

2 結果

2.1 正常對照組與生理鹽水組的Th1，Th2 失衡分析 IFN-γ 代表Th1 型細胞因子，IL-4、IL-5 代表Th2 型細胞因子，可通過小鼠血清細胞因子的變化分析建模后Th1、Th2 失衡的情況。如表1 所示，生理鹽水組較正常對照組IL-4 和IL-5 水平均有顯著升高(P ＜0.05)，IFN-γ 則有顯著降低(P ＜0.05)。

表1 正常對照組與生理鹽水組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.1 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ between the control group and saline group in mice serum (±s)

表1 正常對照組與生理鹽水組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.1 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ between the control group and saline group in mice serum (±s)

注:與正常對照組比較，* P ＜0.05

組別 動物數IL-5/(pg·mL -1)IL-4/(pg·mL -1)IFN-γ/(pg·mL -1)10 13.00 ±2.09 14.60 ±3.50 389.76 ±22.34生理鹽水組 10 48.09 ±7.23* 47.18 ±4.46* 135.18 ±20.01正常對照組*

2.2 干預后各組小鼠血清中IL-5、IL-4、IFN-γ 的變化 黑斑蛤蚧干預組、地塞米松干預組與生理鹽水組相比較，IL-4 和IL-5 水平均有顯著降低(P ＜0.05)，IFN-γ 則有顯著提高(P ＜0.05);黑斑蛤蚧干預組與地塞米松干預組比較，地塞米松下調IL-4 和IL-5 水平和上調IFN-γ 水平的作用均強于黑斑蛤蚧(P ＜0.05)，見表2。

表2 干預后各組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.2 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ after the intervention (±s)

表2 干預后各組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.2 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ after the intervention (±s)

注:與生理鹽水組比較，* P ＜0.05;與地塞米松干預組比較，ΔP ＜0.05

組 別 動物數 IL-5/(pg·mL -1) IL-4/(pg·mL -1) IFN-γ/(pg·mL -1)黑斑蛤蚧干預組 10 22.93 ±1.33* Δ 15.12 ±2.87* Δ 325.66 ±27.17*Δ地塞米松干預組 10 17.00 ±3.36* 11.60 ±2.82* 353.11 ±25.24*生理鹽水組10 48.09 ±7.23 47.18 ±4.46 135.18 ±20.01

2.3 各組小鼠干預后Th1、Th2 相關的細胞因子相關性分析 IL-4 和IL-5 屬于Th2 系統的細胞因子，而IFN-γ 屬于Th1 系統的細胞因子。為比較蛤蚧在干預過程中是否因IL-4 和IL-5 與IFN-γ 水平失衡的關系導致哮喘癥狀減輕，對Th1、Th2 相關的細胞因子相關性進行分析。

黑斑蛤蚧干預組的IFN-γ 水平分別與IL-4、IL-5 水平呈負相關(r = -0.61， -0.71)，IL-4、IL-5 水平呈正相關(r=0.62)，P 值均＜0.05。地塞米松干預組的IFN-γ 水平分別與IL-4、IL-5 水平呈負相關(r = -0.76， -0.75)，IL-4、IL-5 水平呈正相關(r=0.76)，P 值均＜0.05。生理鹽水組IFN-γ 水平分別與IL-4、IL-5 水平呈負相關(r =-0.53，-0.62)，IL-4、IL-5 水平呈正相關(r =0.65)，P 值均＜0.05。見表3。

表3 小鼠血清細胞因子相關性分析Tab.3 Correlational analysis of cytokines in mice serum

2.4 黑斑蛤蚧與地塞米松的療效比較 IL-4 和IL-5 屬于Th2 系統的細胞因子，而IFN-γ 屬于Th1 系統的細胞因子。為比較蛤蚧在干預過程中對Th1/Th2 的影響，Th1/Th2 的平衡情況通過IFN-γ/ IL-4和IFN-γ/ IL-5 反映。如表4 所示，3 組比較，地塞米松干預組與黑斑蛤蚧干預組的IFN-γ/ IL-4 和IFN-γ/ IL-5 均比生理鹽水組有顯著升高 (P ＜0.05)，兩組間比較，地塞米松干預組較黑斑蛤蚧干預組有顯著升高(P ＜0.05)，而黑斑蛤蚧干預組較生理鹽水組有顯著提高(P ＜0.05)。

表4 黑斑蛤蚧與地塞米松的療效比較(±s)Tab.4 Comparison of therapeutic effects between blackspotted geckos and dexamethasone (±s)

表4 黑斑蛤蚧與地塞米松的療效比較(±s)Tab.4 Comparison of therapeutic effects between blackspotted geckos and dexamethasone (±s)

注:與生理鹽水組比較，* P ＜0.05;與黑斑蛤蚧干預組比較，ΔP ＜0.05

組別 動物數 (IFN-γ/IL-4) (IFN-γ/IL-5)黑斑蛤蚧干預組 10 22.30 ±4.96* 14.27 ±1.62*地塞米松干預組 10 30.44 ±9.16* Δ 20.77 ±5.86* Δ生理鹽水組10 2.87 ±0.65 2.81 ±0.76

3 討論

目前認為Th1/Th2 細胞平衡失調，機體正常的免疫耐受功能受損，從而導致免疫細胞及其成分對機體自身組織結構和功能的破壞，是哮喘發病的基礎［7］。其失衡的程度與哮喘的發病關系密切。其中IFN-γ 及IL-4、IL-5 是調節Th1/Th2 細胞平衡重要細胞因子。IL-4 是Th2 細胞的特征性細胞因子，由Th0 細胞產生，誘導Th0 細胞向Th2 細胞轉化［8］，并且可調控Th1 細胞向Th2 細胞分化［9］。IL-5 主要調節嗜酸性粒細胞生長、分化及其活性的細胞因子。研究表明，在小鼠氣管內注入IL-5 可引起肺嗜酸性粒細胞明顯增多及誘導氣道增生或化生的黏液細胞凋亡增加［10］。IFN-γ 對IL-4 的拮抗作用可能是通過阻斷GATA-3 的表達，抑制IL-4、IL-5 的合成從而降低體內IgE 的水平［11］。在哮喘發生時，高水平的IL-5 在IL-4 條件下可促使Th0細胞向Th2 分化，并且可間接抑制Th1 分泌IFNγ、IL-2 等炎癥抑制因子，阻礙Th0 細胞向Th1 分化，造成Th1/Th2 的失衡而引發哮喘［12］。通過調節哮喘Th1 和Th2 細胞因子的平衡，從而逆轉Th1/Th2 失衡或許是治療哮喘的新途徑。

目前，哮喘的治療仍有爭議，糖皮質激素治療是目前公認的最有效的藥物治療，尤其是吸入糖皮質激素可下調氣道上皮炎癥因子的表達［13］。雖然效果明顯，但是長期使用糖皮質激素治療會產生嚴重的副作用。

本研究顯示，黑斑蛤蚧對哮喘小鼠進行干預后，Th1 型細胞因子IFN-γ 水平顯著升高，而Th2型細胞因子IL-4、IL-5 水平顯著降低，并且IFN-γ和IL-4、IL-5 均呈現出負相關性，表明黑斑蛤蚧對哮喘模型小鼠外周血Th1/Th2 系統具有一定的免疫調節作用。同時研究數據也顯示，地塞米松干預組與黑斑蛤蚧干預組相比較，黑斑蛤蚧下調IL-4和IL-5 水平和上調IFN-γ 水平的作用均不及地塞米松。黑斑蛤蚧藥用部位是去除內臟的全身，中醫認為具有助陽益精、補肺益腎、納氣定喘的功效。近年來許多研究表明，蛤蚧具有抗腫瘤、平喘、性激素樣、抗炎等作用，本研究針對黑斑蛤蚧對哮喘模型的作用，初步探討其作用機制。對蛤蚧在哮喘治療中的免疫調節相關性還需作進一步探討，明確其有效成分、劑量、療效，為臨床應用提供實驗依據。

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