ipt基因在植物基因工程中的應用

陳夢瑩，陳祥福，崔萌，魏娟娟，潘陽露，潘宇，李金華，張興國

（西南大學園藝園林學院，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶，400715）

ipt基因在植物基因工程中的應用

陳夢瑩，陳祥福，崔萌，魏娟娟，潘陽露，潘宇，李金華，張興國

（西南大學園藝園林學院，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶，400715）

異戊烯基轉移酶IPT是細胞分裂素生物合成過程中的限速酶，其編碼基因ipt已被克隆并得到廣泛應用。簡要介紹了在植物遺傳轉化中控制ipt表達的啟動子，綜述了ipt在植物基因工程中的應用，并分析了目前ipt基因在植物基因工程應用中存在的一些問題。

異戊烯基轉移酶基因（ipt)；植物基因工程

細胞分裂素（Cytokinin，CTK）是促進細胞分裂的激素，在植物生長發育過程中行使重要功能，如參與細胞分裂、光合作用、衰老及營養代謝等過程。1963年，Letham從未成熟的甜玉米中發現并純化得到細胞分裂素，俗稱玉米素（Zeatin），這與先前報道Miller從玉米中分離但未完全純化的細胞分裂物質相同[1]。細胞分裂素從化學角度看主要分為兩類，一類是在天然細胞分裂素異戊烯腺嘌呤N6位上進行取代，側鏈通常為芳香環衍生物或類異戊二烯基，包括6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）等，稱嘌呤型細胞分裂素；另一類為苯基脲型細胞分裂素，即N，N'-二苯基脲（DPU）以及一些苯基脲的衍生物，如噻重氮苯基脲、N-（4-吡啶基）N'-苯基脲、N-苯基-N'-（2-氯-4-吡啶基）脲等。目前，在細胞分裂素生物合成過程中起關鍵作用的一些酶的特性已得到研究，有些還被克隆出了對應的基因[2]。其中，異戊烯基轉移酶（Isopentenyl-transferase，IPT）是植物細胞分裂素生物合成中的限速酶。異戊烯基轉移酶基因最初在根癌農桿菌中得到鑒定，命名為tmr，后稱為ipt，IPT酶的活性也逐步在多種植物的粗提取物中被檢測到[3，4]。隨著擬南芥基因組測序工作的完成，編碼IPT的基因家族也被證實，包括9個成員證明除以外，其他7個基因能夠編碼大腸桿菌中細胞分裂素的生物合成[5]。異戊烯基轉移酶基因（ipt）的廣泛應用，對深入了解細胞分裂素的生理作用及通過植物基因工程技術控制植物生長發育方面具有重要意義，也使植物激素的基因工程在遺傳育種中的應用方面展現了新的作用。

1 基因工程中ipt基因表達的調控

早期研究發現，使用IPT和花椰菜花葉病毒（CaMV）35S這兩種啟動子控制ipt基因在轉化植株中表達，發現其控制下的ipt基因均組成型過量表達，產生的細胞分裂素濃度較高，從而導致一系列反常的發育，如抑制莖伸長、喪失頂端優勢、抑制側根形成、表現矮化及形成小圓葉[6～8]。為解決該問題，各類非組成型表達啟動子被用來控制ipt基因的表達（表1），使其表達水平、表達的空間和時間受到限制。

表1 ipt在植物基因工程中使用的啟動子

2 提高轉化效率

細胞分裂素能促進植物組織的分化和生長，是誘導植物不定芽分化的關鍵激素。當煙草等植物表達外源ipt基因時，不定芽再生得到了促進[10]。ipt基因促進了矮牽牛遺傳轉化中不定芽的誘導，不定芽誘導率顯著高于對照[8]。這種效應已用來解決難以再生植物的離體分化問題。當 基因轉入杜仲后，其不定芽誘導率為2.95%，比未轉ipt基因的對照有明顯增加，說明ipt作為外源基因轉入不定芽誘導困難的植物杜仲，提高了其遺傳轉化效率[12]。

3 作為選擇標記基因

ipt基因表達能促進不定芽分化并導致轉基因植物表型反常變化，具有誘導表型效應。因此，ipt可作為簡單表型標記來篩選轉化子，直觀地指示是否得到轉基因植株[22]。使用ipt基因作為選擇標記，使轉基因組織能在沒有細胞分裂素的培養基上完成分化[29]。將35S-ipt基因與卡那霉素同時使用時，轉化效率比單獨使用卡那霉素提高1.6倍，說明抗生素與ipt結合使用效果會更好[30]。

使用位點特異性重組系統，無ipt等選擇標記的轉基因系統已建立。擬南芥熱激啟動子hspl8.2可驅動flp重組酶基因，從而熱誘導刪除外源基因，當與ipt基因串聯后，獲得轉基因植株后進行熱激處理，刪除ipt標記基因，使植物的生長發育恢復正常[8]。Cre重組酶系統可以從轉基因柑橘中高效刪除ipt標記基因，達到非常高的刪除效率[11]。利用重組酶系統刪除轉基因植物中的篩選標記基因等外源基因，可消除人們對轉基因植物的安全顧慮，是目前轉基因安全控制的研究方向之一。

4 延緩衰老

在20世紀30年代末就有科學家發現細胞分裂素可以延緩葉片衰老。有研究表明，細胞分裂素是一種有效的抗衰老調節劑，其作用機理主要涉及以下幾個方面：a.提高細胞外轉化酶的活性；b.促進活性氧的清除，以減緩脂質氧化程度而延緩衰老；c.降低對乙烯和ABA的敏感性[31]。

有研究發現，通過基因工程手段將ipt基因導入植物中，可以控制植株的生長和衰老。Smigocki等[32]用融合基因轉化煙草，延遲了整個植株的衰老。張賽群等[13]通過根癌農桿菌介導，構建嵌合基因，并對5個番茄品種進行遺傳轉化，最后獲得來自31個不同外植體的44棵轉化再生植株，對其中一部分單株進行PCR檢測證明為轉基因植株，觀察其田間生長狀況，發現其生長旺盛并表現出抗葉片衰老的特性。張治禮等[15]將嵌合基因導入櫻桃番茄，對其中14株轉化植株與對照中的2株進行葉片葉綠素、細胞分裂素檢測，結果表明，與對照相比，不同葉位的葉片葉綠素、細胞分裂素含量顯著提高，而同一葉位的葉片則與對照相比延緩15～20 d衰老。Lai等[33]研究了聚乙二醇滲透脅迫對轉大丁草葉片中抗氧化酶活性的影響，抗氧化酶活性被激活后，在轉基因植株中的活性比未轉基因對照提高很多，說明滲透脅迫誘導的延緩葉片衰老是抗氧化酶活性增高引起的。利用根癌農桿菌介導法將嵌合基因導入棉花中，經過卡那霉素抗性篩選和檢測共獲得9個轉基因株系，后期測定結果表明，葉片細胞分裂素、葉綠素及可溶性蛋白等的含量明顯高于對照，轉基因棉花葉片衰老得到延緩[34]。Huo等[25]使用大豆GmSARK啟動子來調控ipt基因表達，qRT-PCR的結果表明ipt基因在轉基因擬南芥中的表達受衰老的特異性控制，并延緩了葉片衰老。

5 參與防御反應

與其他植物激素類似，細胞分裂素在植物遭受逆境脅迫時能夠及時響應并調控植物的生長發育。此外，細胞分裂素還可以與其他內源激素共同參與反應，通過使植物體內的生理產生變化來避免植物受病蟲害干擾等。在與一些逆境脅迫相關的蛋白方面，細胞分裂素對其誘導和調控也起著重要作用。

ipt基因在轉基因水稻中表達，使葉綠素含量增加、光合作用增強，使根系保持較高的活力，增強根對營養物質和礦質元素的吸收和利用，也抵御了低溫的為害[35]。逆境啟動子rd29A在4℃低溫誘導12 h時，能夠很好地調控ipt基因的表達，使煙草外植體在遭受逆境脅迫時也能正常分化，達到較高的抗性愈傷誘導率[24]。劉麗君等[36]在轉基因的大豆中，通過內源IAA、ABA含量的增加，SOD酶活性增強，MDA（丙二醛）含量減少，來改變大豆的形態以提高抗病性。玉山江等[37]對 ipt轉基因秈稻植株進行干旱脅迫，發現其細胞分裂素含量和葉綠素含量顯著高于野生型，很大程度上延緩了莖葉衰老，葉片溫度顯著低于野生型。孫雷心[38]通過馬鈴薯創傷誘導啟動子調控改良過的細胞分裂素基因在植物中表達，可使植物在僅遭受食害或創傷時產生該種激素并促進了傷口愈合，與導入抗蟲基因相比更接近于植物的天然防御能力。

6 指導有機物質的積累與分配

細胞分裂素可以指導植物中有機質的分布，這為改良作物品質及提高蛋白含量提供了一種可能的途徑。毛自朝等[17]將果實特異性啟動子2A12控制的ipt基因在番茄中表達，發現果實中細胞分裂素含量增高從而使果實中胎座組織增厚和種子發育停滯，最后得到無籽番茄果實；由于ipt基因的表達使果實成熟過程受阻，也使得果實采后儲藏時間延長了10 d左右，隨后研究發現，轉基因番茄的坐果率和產量都有不同程度的提高，可溶性糖含量略低，但果實中粗蛋白和干物質含量都有明顯增高。王亞琴等[39]將葉片衰老抑制基因經基因槍導入秈稻，轉基因植株的有效穗數和千粒質量比對照顯著增加，說明其在延緩葉片衰老的同時能提高葉片利用光能的時間，從而積累大量的光合產物。小麥高分子量麥谷蛋白亞基12啟動子與ipt基因嵌合后轉化煙草，使細胞分裂素含量有所增加，且少量細胞分裂素的異常表達在一定程度上使貯藏同化累積增加[40]。

7 誘導單性結實

單性結實是指在天然或人工作用下使胚珠不經授粉而子房發育形成果實的現象。在胚珠未經受精的情況下，可形成無籽果實。生長素、脫落酸和赤霉素等植物激素對單性結實有顯著的影響，且各激素的平衡比單一激素對單性結實的影響效應要大。環境因子如溫度、光照等也會通過影響植物激素的合成從而間接影響單性結實。利用果實特異性啟動子在番茄中大量表達ipt基因能得到穩定的單性結實株系[41]。

8 產生雄性不育后代

利用植物雄性不育為基礎的雜種優勢已成為許多作物育種的重要目標和方向。到目前為止，利用轉基因的方法獲得植物雄性不育材料已有很多研究。在花藥發育到花粉粒成熟過程中有一系列基因的表達，這些基因的異常表達往往導致部分或全部的花粉敗育。利用花藥絨氈層特異性啟動子TA29調控ipt基因的表達，可使轉基因植株雄蕊中細胞分裂素的含量比對照高出3～4倍，讓原本花藥發育過程中平衡的激素環境發生紊亂，進而使花藥和花粉的正常發育受阻，最后獲得雄性敗育株系[16]。

9 問題與展望

綜上所述，到目前關于ipt基因在植物轉基因中應用的實例已有很多，但仍存在一些問題：

①特異性啟動子控制ipt基因的表達在煙草、番茄等雙子葉植物上的應用較多，而在單子葉植物和多年生植物中的應用相對較少。不同啟動子間的研究也存在差異，如衰老組織特異表達啟動子SAG12的研究應用相對較多，但其他特異性啟動子的研究則較少。

②對轉ipt基因植株中細胞分裂素與生長素的相互作用機制及激素對植物生長發育的影響等方面仍需進一步探索。

③大部分轉ipt基因的研究仍處于植株轉化階段，對轉基因植株的生理方面沒有進行深入研究。在 延遲衰老方面，除了發現延緩下部葉片脫落和細胞分裂素含量增加外，一些轉化植株還存在著許多與野生型不同的特征。因此，在這方面還有待改善并加強分子水平的解釋。

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Application of ipt Gene in Plant Genetic Engineering

CHEN Mengying,CHEN Xiangfu,CUI Meng,WEI Juanjuan,PAN Yanglu, PAN Yu,LI Jinhua,ZHANG Xingguo

Isopentenyl-transferases(IPT)catalyze the first and rate-limiting step of cytokinin biosynthesis,and its coding genes have been cloned and used widely.This paper introduced the promoters controlling the expression of ipt gene in plant genetic transformation briefly,and reviewed the application of ipt in plant gene engineering,at the same time,the paper analyzed the related existing problems.

Isopentenyl-transferase gene(ipt);Plant genetic engineering

Q943.2

A

1001-3547（2014）16-0009-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.16.002

科技部“863”項目資助（2010AA10060705)

陳夢瑩（1990-)，女，碩士，研究方向為蔬菜分子生物學與基因工程，電話：18883734633，E-mail：meng.ying.2009@163.com

張興國，通信作者，研究員，從事蔬菜分子生物學與遺傳育種研究，E-mail：zhangxg63@163.com

2014-06-23