雙水相-微波提取苧麻皮中總黃酮及抗氧化性研究

何慧蓉，黃 藝，鄧選利，但 梅，劉德兵，阮尚全，2*

1內江師范學院化學化工學院;2 四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室，內江 641112

苧麻為蕁麻科苧麻屬多年草本植物，是一種重要的纖維性經濟作物，在我國具有豐富的自然資源，被稱為“中國草”，主要用作紡織工業原料，其產量占世界總產量的80%，四川達州因原麻品質優良已成為苧麻加工企業競相購買的優質原料［1-3］。苧麻副產物苧麻皮通常是被作為廢棄物處理，因其纖維強度較高，既浪費資源又污染環境，因此將其資源化具有重要的經濟價值和生態價值。黃酮類化合物是一類低分子量而廣泛分布于植物界多的天然植物成分，為植物多酚類的代謝產物，因具有很好的清除自由基和抗氧化能力，對抗癌腫瘤、內分泌調節具良好的作用，受到國內外學者高度重視［4，5］。本實驗采用雙水相-微波輻射提取了苧麻皮中的黃酮，建立了苧麻皮中黃酮提取的新方法，并對萃取物清除超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力進行了初步實驗，對苧麻生產中的廢棄物利用具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用苧麻皮采于達州市大竹縣。蘆丁(BR)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

Uwave-1000 微波.紫外.超聲波三位一體合成萃取反應儀(上海新儀);T6 新世紀紫外可見分光光度計(北京普析);TD-5 臺式低速離心機(四川蜀科);DFT-100 型中藥粉碎機(溫嶺);AE240 電子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

苧麻皮→烘干→粉碎→過篩→微波提取→分離→定容→顯色→測定。

1.3.2 標準曲線的繪制

取蘆丁標準樣品0.0200 g 于100 mL 容量瓶，用30%乙醇溶解并定容，取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 mL 比色管中，采用文獻［6］方法測定。以吸光度A 為縱坐標，蘆丁標準溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標，用最小二乘法作線性回歸曲線。實驗測得標準曲線回歸方程為:A=0.0114C-0.0019，相關系數R2=0.9993，蘆丁濃度在8.0～56.0 μg/mL 范圍內線性關系良好。

1.3.3 黃酮的提取

烘干粉碎樣品，準確稱取1.000 g，加入30 mL 40%的乙醇溶液和硫酸銨0.2 g/mL 形成雙水相，于微波中提取，微波功率為200 W，微波時間為120 s，離心分離，離心液用蒸餾水定容制成100 mL。取2 mL 溶液于比色管中，加入30%乙醇8 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL，6 min 后加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，6 min 后加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用蒸餾水定容搖勻，于波長511 nm 處測定吸光度。

1.3.4 抗氧化性研究

1.3.4.1 清除·OH 活性

H2O2與Fe2+作用產生·OH，水楊酸能與·OH作用產生在510 nm 波長處有強吸收的有色物2，3-二羥基苯甲酸。向反應中加入被測物，則會與水楊酸競爭·OH，使有色物生成量減少。對·OH 清除的測定方法按文獻［7］進行實驗。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 硫酸銨用量對黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同用量的硫酸銨。實驗表明:總黃酮提取率隨著硫酸銨用量增加而升高，達飽和后影響不顯著。其主要原因是，隨著硫酸銨用量的增加，雙水相體系的分相能力逐漸增大，故黃酮提取率會增大，但硫酸銨用量飽和與否對提取率影響不大。因此硫酸銨的用量確定為0.2 g/mL［9，10］。見圖1。

圖1 硫酸銨用量對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of the dosage of (NH4)2SO4on extraction yield of total flavonoids

2.1.2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同濃度的乙醇溶液。實驗表明:總黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而增加，在乙醇濃度60%處達到最高，隨后又逐漸降低。因為黃酮溶于乙醇，乙醇濃度越高，黃酮更加容易擴散到提取劑中來，故提取率會增加，但在雙水相體系中，乙醇的濃度過高，會破壞雙水相體系的穩定性，從而降低了黃酮的提取率。因此，確定乙醇濃度60%。見圖2。

圖2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the concentration of ethanol on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 料液比對黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同的料液比。實驗表明，總黃酮提取率隨著料液比的增大而增加，在加入40mL 乙醇溶液時達到最高，隨后變化不大。由于黃酮醇溶性好，故增加溶劑的用量有利于黃酮向提取液中擴散，這樣黃酮提取率會增加，但原料一定的情況下，多余的乙醇作用不大。所以在料液比1∶40 達到最高，隨后變化不大，因此選擇料液比1∶40。見圖3。

圖3 料液比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ratio of solid solution on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 微波功率對黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同微波功率。實驗表明，總黃酮提取率隨著微波功率的增加而增大，在功率為150 W 時達到最高，然后降低。微波功率越大對樣品作用得越充分，黃酮更易擴散到溶劑中，黃酮提取率會增加，但微波功率過大，則升溫速率越大，溫度會越高，這樣可能導致黃酮被氧化或分解加多，同時也會使乙醇揮發加快，從而使黃酮提取率下降。見圖4。

圖4 微波功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction yield of total flavonoids

2.1.5 提取時間對黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同提取時間。實驗表明，總黃酮提取率隨著微波時間的增加而增大，在微波時間為100 S 時達到最高，之后逐漸降低。延長提取時間可使目標產物提取更徹底，提取率會增加，但加熱時間延過長，可能使黃酮發生分解或氧化，并且時間越長乙醇揮發得越多，故黃酮提取率會降低，因此確定提取時間為100S。見圖5:

圖5 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2 提取產物的定性鑒定

取2mL 提取液，加入適量試劑，觀察顏色變化見表1，結果與文獻一致［11］，由此具有黃酮類化合物存在。

表1 黃酮類化合物的鑒定結果Table 1 Identification results of the flavonoid

2.3 正交實驗

單因素實驗結果表明，硫酸銨用量對總黃酮提取率影響相對較小，料液比、微波功率、提取時間、乙醇濃度對提取率影響較大，故選取影響較大的因素進行正交試驗設計。取三個水平按L9(34)設計成正交實驗。實驗結果見表1。

表2 L9(34)正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal test L9(34)

表3 L9(34)正交試驗結果Table 3 Result of orthogonal experiment L9(34)

實驗表明:料液比、微波功率、提取時間、乙醇濃度、硫酸銨用量等因素均對苧麻皮中總黃酮的提取有影響，各因素對總黃酮提取率的影響主次順序為:A ＞B ＞C ＞D。從苧麻皮中提取黃酮的工藝條件最優組合為A3B3C3D3，即在硫酸銨用量為0.2 g/mL的條件下:料液比1∶50，微波功率200 W，微波提取120 s，乙醇濃度70%時為最佳提取條件。驗證試驗:在最優條件下進行3 次平行實驗，苧麻皮的黃酮提取率分別為:2.4075%、2.4879%、2.4305%，平均提取率為2.4420%，RSD 為1.6%，表明實驗設計合理可行。

2.4 提取物的抗氧化性實驗

2.4.1 清除·OH 活性的測定

參照1.3.4.1 方法進行試驗，清除·OH 活性的結果如圖6。

圖6 黃酮對·OH 清除率Fig.6 Scavenging rates of total flavonoids to ·OH

由圖可以看出，在8.77～87.7 μg/mL 的濃度范圍內，其·OH 清除率為3.97～83.41%，·OH 清除能力隨著總黃酮質量濃度的增加而逐漸增強。

圖7 黃酮對清除率Fig.7 Scavenging rates of total flavonoids to

由圖可以看出，在8.77～87.7 μg/mL 的質量濃度范圍內，其清除率為3.09～69.33%清除能力隨著總黃酮質量濃度的增加而逐漸增強。

3 結論

文章采用單因素和正交試驗設計，雙水相協同-微波法提取了苧麻皮中的總黃酮，并對提取產物試驗了清除·OH 和活性測定。最后試驗得最佳工藝條件為:硫酸銨用量0.2 g/mL，料液比1∶50，微波功率200 W，微波提取時間120 s，乙醇濃度70%。本法作為一種天然產物黃酮提取的新技術，具有條件溫和，快速的特點。苧麻皮中的黃酮具有良好的抗氧化性，實驗結果具有一定的適用價值，為今后苧麻產業的發展具有一定的作用。

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