當歸中藁本內酯在大鼠體內的藥代動力學研究

楊 嵐，劉佳麗，郭秉榮，崔 杰，秦雪梅，高曉霞*

1山西大學中醫藥現代研究中心;2 山西大學化學化工學院，太原 030006

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，始載于《神農本草經》，素有“血家百病此方通”之說，鑒于該味藥作用之廣，近年來對于其物質基礎及藥理活性的研究頗多，據文獻［1-3］報道:當歸揮發油具有舒張血管、抗血小板凝集、保護神經等功效，藁本內酯則是其中主要的起效成分之一［4］。本課題組前期在研究抗抑郁藥逍遙散的物質基礎時發現，逍遙散乙醇提取物經石油醚萃取后所得的萃取物抗抑郁活性較高，其中藁本內酯為該復方中當歸的主要貢獻成分［5］，并且“逍遙散復方藥代動力學初探”［6］與“血清藥物化學”的研究結果也表明其在大鼠體內有明顯入血，因此明確當歸中該成分在大鼠體內的藥動學特性勢在必得。目前，關于該成分的研究焦點主要集中于藥理活性，有關藥代動力學的研究卻為數不多，僅有的幾篇也只以單體或川芎揮發油中該成分作為研究對象［7，8］，而同樣作為當歸中較為重要的活性成分之一，以當歸石油醚萃取物作為給藥主體的藥動學研究尚未見報道。本文建立了UPLC-PDA 方法測定當歸石油醚萃取物中藁本內酯血藥濃度，并對其大鼠體內的藥代動力學進行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLCTMPDA，美國Waters);Sartorius 電子分析天平(德國賽多利斯SARTORIUS 有限公司);高速冷凍離心機(TGL-6，長沙湘儀離心機有限公司);真空干燥箱(上海躍進醫療器械廠);微量移液器(200 μL，1 mL，Thermo);氮吹儀裝置(實驗室自制)。

1.2 藥品與試劑

當歸購于山西省華陽藥業有限公司，經山西大學中醫藥現代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為正品，且留樣于山西大學中醫藥現代研究中心。藁本內酯、內標異歐前胡素對照品(純度98%)均購自上海順勃有限公司。

石油醚、95%乙醇、甲醇、乙腈、乙醚和異丙醇均為分析純，購自北京化工試劑公司;純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司;色譜級甲醇和乙腈購自Fisher Scientific(USA)。

1.3 實驗動物

健康雄性SD 大鼠16 只，體重260 ±20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(京2006-0008)。將大鼠置于晝夜節律光照條件下，自由進食進水，飼養7 d 適應環境，每日觸摸動物以適應實驗人員的操作。

2 實驗方法

2.1 當歸石油醚萃取物的制備

取當歸藥材適量，加8 倍量95%乙醇，回流提取3 次，第1、2 次每次2 h，第3 次1 h，合并回流液，過濾，回收乙醇至無醇味，加水分散，濃縮至浸膏(棕色粘稠液)，加入與浸膏等體積的石油醚，超聲提取(每次30 min)，至萃取液近乎無色時，合并石油醚萃取液，旋轉蒸發，回收溶劑并濃縮至浸膏，于真空干燥箱(60℃)中干燥，即得(出膏率1.36%)。

2.2 對照品溶液的制備

稱取藁本內酯對照品約5.00 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得藁本內酯0.497 mg/mL 的對照品儲備液，并經甲醇稀釋成不同濃度的系列標準溶液，貯存于-20℃冰箱內，備用。

2.3 灌胃液的制備

當歸石油醚萃取物用調和食用油超聲溶解制得灌胃液，藁本內酯濃度分別為3.768、1.884、0.942 mg/mL(按藁本內酯含量折算)。

2.4 血清樣品的采集

SD 大鼠18 只，隨機分成3 組(即低劑量組、中劑量組、高劑量組)，每組6 只。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。稱量大鼠體重，將當歸石油醚萃取物灌胃液以10 mL/kg 的標準分別對三組灌胃給藥，并于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、5 和8 h 經眼眶靜脈叢取血0.5 mL，靜置0.5 h 后，4000 rpm 離心10 min。移取上清液，-80 ℃冷藏待用。

2.5 血清樣品預處理

精密吸取血清200 μL，置10 mL EP 離心管中，依次加入濃度為1 μg/mL 的內標異歐前胡素50 μL，甲醇50 μL，萃取劑正己烷2 mL，渦旋混合3 min，3000 rpm 離心10 min，分取上層清液至另一10 mL EP 離心管中，下層殘渣再加正己烷2 mL 萃取，合并兩次萃取液，常溫下N2流吹干，殘渣加入100 μL 甲醇超聲溶解3 min，渦旋混合2 min 后，轉移至0.5 mL EP 離心管中，于13000 rpm 離心5 min，取上清液，自動進樣分析。

包括固定資產貸款在運營期內的年利息支出和流動資金貸款利息支出。南水北調一期工程貸款償還期25年，按現行五年期以上貸款基準利率6.55%計算。

2.6 色譜條件

色譜柱:BEH C18(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm);流動相:乙腈-水(0.03%三氟乙酸)(45∶55，v/v);流速:0.5 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:5 μL;檢測波長:320 nm。

3 實驗結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性

取空白血清、空白血清加對照品、受試大鼠灌胃當歸石油醚萃物0.25 h 后的血清樣品按“2.5”項處理，進樣分析。所得代表色譜圖，見圖1。結果表明，血漿樣品中藁本內酯與內標異歐前胡素的保留時間分別為3.7 和4.9 min。經過比較顯示血清中的內源性物質對內標和待測物質均無干擾，專屬性良好。

圖1 空白血清(A)、空白血清加對照品(B)及大鼠灌胃當歸石油醚萃取物0.25 h 后血清樣品(C)的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of blank serum (A)，blank serum spiked with ligustilide andisoimperatorin standards (B)and serum sample after ig administration of petroleum ether extract of A.Sinensis at 0.25 h (C)

3.1.2 標準曲線與定量下限

空白血清200 μL，分別加入50 μL 內標溶液和50 μL 標準系列溶液，配制成含藁本內酯濃度為9.144、4.572、1.828、0.914、0.457、0.183、0.091 μg/mL 的血清樣品，按“血清樣品預處理”項下方法操作并測定，記錄色譜圖。以藁本內酯峰面積與內標物峰面積之比(Y)對藁本內酯質量濃度(X)進行加權最小二乘法線性回歸，所得回歸方程為:Y=1.161X-0.021(r2=0.9981)，線性范圍:0.091～9.144 μg/mL，線性良好。血清中藥物的最低檢測濃度(LLOQ)為0.091 μg/mL。

3.1.3 精密度與準確度

取空白血清200 μL，按照“標準曲線與定量下限”項下方法，分別制備藁本內酯高、中、低3個濃度(濃度分別為7.315、0.914、0.183 μg/mL)的藁本內酯血清質控(QC)樣本，并測定高、中、低濃度的日內精密度與準確度;同法連續測定3 d，計算日間RSD 與RE。數據均以“D”表示，結果符合方法學要求，高、中、低濃度的日內和日間RSD 值與RE 值均＜10%，見表1。

表1 測定方法的精密度與準確度(n=6)Table 1 Precision and accuracy of the developed UPLC method (n=6)

3.1.4 回收率實驗

表2 測定方法的回收率(n=6)Table 2 Recovery of the developed UPLC method (n=6)

3.1.5 穩定性實驗

配制高、中、低3 種濃度7.315、0.914、0.183 μg/mL 的藁本內酯血清質控樣品各6 份，按如下3種方法處理后測定，(1)凍融循環穩定性:反復凍融3 次后處理并測定;(2)短期穩定性:將處理好的樣品于室溫下放置4 h 后測定;(3)長期穩定性:將“2.5 項”下所得殘渣置-20 ℃冷凍10 d 后測定。數據均以“D”表示，見表3。

表3 樣品穩定性的測定(n=6)Table 3 Stability of sample (n=6)

3.2 藥動學測定結果

將大鼠灌胃當歸石油醚萃取物后血清樣品在上述方法下測定，將峰面積比值按標準曲線計算出藁本內酯的血藥濃度，數據運用DAS 3.0 進行處理。結果表明低劑量組未檢測到，而高、中劑量組的藁本內酯在大鼠體內較符合二室模型，各項藥動學參數見表4，所有數據均以“D”表示。藁本內酯在大鼠體內的藥-時曲線見圖2。

表4 大鼠灌胃當歸石油醚萃取物后藁本內酯藥動學參數Table 4 Pharmacokinetic parameters of ligustilide in rats after i.g.administration of petroleum ether extract of A.Sinensis (Oliv.)Diels

圖2 藁本內酯在大鼠體內的藥-時曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of ligustilide after i.g.administration of petroleum ether extract of A.Sinensis (Oliv.)Diels to rats (n=6)

4 討論

4.1 萃取劑的考察

分別考察了乙醚、正己烷、乙醚+10%HCl、正己烷+10%HCl 等4 種萃取溶劑，結果發現，正己烷萃取時的萃取效率最高，且不會出現乳化現象，內源性物質對被測物和內標物的干擾小，操作簡單快速、成本低，且可以保證提取回收率和方法重現性，所以選擇該溶劑為血清樣品萃取劑。

4.2 流動相的考察

本研究發現，藁本內酯在甲醇-水流動相系統中不能與內源性物質很好的分開，而選擇乙腈-水作為流動相時能達到良好的分離效果。除此之外針對峰形稍微拖尾的現象，本實驗分別考察了向水中加入0.03%三氟0.1%乙酸、0.1%甲酸，經比較，前者效果良好，故最終確定乙腈-0.03%三氟乙酸水作為流動相。

4.3 雙峰現象的推測

藥動學實驗結果表明化合物藁本內酯藥-時曲線呈雙峰現象，且第一峰高大于第二峰，出現該現象的原因可能是受肝腸循環或不同腸斷吸收差異的影響，也可能是不規則胃排空導致。

4.4 藥動結果的闡明

為了探討當歸石油醚萃取物中藁本內酯的在大鼠體內的藥動學特性，我們選取高、中、低三個劑量進行實驗。結果顯示，低劑量組由于藁本內酯的含量過低，吸收不明顯，受方法的靈敏度限制，含量已降至定量限下，無法進行定量。而高、中劑量組藁本內酯分別在0.20、0.19 h 達峰，t1/2β分別為4.08、3.06 h 左右，表明藁本內酯具有吸收快，消除亦快，在體內維持有效血藥濃度時間較短等特點。高、中劑量組的AUC 分別為0.95、0.61(μg/mL·h)，此結果與Chen YY［7］的研究結果較為一致。根據表觀分布容積參數V1/F 得知，其數值遠大于大鼠體液體積0.67 L/kg，因此藁本內酯同樣具有分布廣的特點。從高、中劑量組大鼠的參數及藥-時曲線可以看出，兩者吸收相當，有可能是因為中劑量時藥物吸收已經飽和，增加劑量并不能使生物利用度相應的增加，表明當歸中該成分為非劑量依賴型，此項結果與其他文獻報道有所差異，Ru Yan［9］在研究大鼠腹腔注射川芎藥代動力學時發現，川芎中藁本內酯呈劑量依賴型，造成如此差異的原因可能是所選給藥劑量區間有所差異或是不同藥材中其余化學成分的影響導致。

綜上，本實驗建立的UPLC-PDA 法可靠、靈敏，能夠快速、準確的測定藁本內酯在大鼠體內的血藥濃度，所得藥動學結果，可為臨床合理用藥提供一定基礎。

1 Chan SK，Cheng TY，Lin G.Relaxation effects of ligustilide and senkyunolide A，two main constituents of Ligusticum chuanxiong，in rat isolated aorta.J Ethnopharmacol，2007，111:677-680.

2 Kuang X，Yao Y，Du JR，et al.Neuroprotective role of Z-ligustilide against forebrain ischemic injury in ICR mice.Brain Res，2006，1102:145-153.

3 Kuang X，Du JR，Liu YX，et al.Postischemic administration of Z-ligustilide ameliorates cognitive dysfunction and brain damage induced by permanent forebrain ischemia in rats.Pharmacol Biochem Behav，2008，88:213-221.

4 Guo JM，Shang EX，Duan JA，et al.Determination of ligustilide in the brains of freely moving rats using microdialysis coupled with ultra performance liquid chromatography/ mass spectrometry.Fitoterapia，2011，82:441-445.

5 Ren YL(任艷玲).Studies on chemical composition and quality control of antidepressant fractions from Xiaoyaosan.Taiyuan:Shanxi University(山西大學)，MSc.2012.

6 Cui J(崔杰).Preliminary study on pharmacokinetics of antidepressant effective fraction from xiaoyaosan based on serum pharmacochemistry.Taiyuan:Shanxi University (山西大學)，MSc.2012.

7 Chen YY(陳欲云)，Yu Y(余彥)，Chen C(陳雛)，et al.Pharmacokinetic profile of Z-ligustilide in rat plasma and brain following oral administration.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2010，22:126-131.

8 Liu Y(劉洋)，Hu LD(胡連棟)，Tang X(唐星)，et al.Pharmacokinetics of ligustilide in Ligusticum chuanxiong essential oil in rats in vivo.Chin Tradit Herbal Drugs(中草藥)，2009，40:228-230.

9 Ru Y.Pharmacokinetics and metabolism of ligustilide.Drug Metab Dispos，2007，36:400-408.