合歡皮總皂苷對人微血管內皮細胞體外增殖的影響

馮 磊，譚 瑩，陳 爽，邱麗穎*，金 堅

1江南大學無錫醫學院;2 江南大學藥學院，無錫 214122

合歡屬Albizzia 為豆科含羞草亞科植物［1］，是Albizzia julibrissin Durazz 的樹皮［2］，具有解郁安神、活血消腫之功效。已有文獻報道合歡皮乙醇粗提物在體內明顯抑制血管生成，阻止腫瘤細胞生長、侵襲和遷移，同時存在一定的毒性作用［3-9］。本文通過制備合歡皮總皂苷，考察其對人微血管內皮細胞(HMEC-1)增殖的抑制作用，細胞形態學變化、細胞周期分布改變，初步探討其抑制細胞增殖的機制。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

實驗所用細胞株為SV40 猿猴空泡病毒轉染人臍靜脈微血管內皮細胞HMEC-1(Human Microvascular Endothelial Cells)，由法國國家衛生醫藥研究院U553 研究所提供。

1.2 藥物與試劑

合歡皮為豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz 的干燥樹皮，購自無錫山禾集團健康參藥連鎖有限公司，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定，符合《中華人民共和國藥典》2010 版標準［10］;細胞全基因DNA 抽提試劑盒，購自北京天根生物技術有限公司;SRB、PI 均購自美國Sigma 公司。

1.3 主要儀器

SY18-WJ2/3 型CO2細胞培養箱(美國賽默飛世爾科技公司);SW-CJ-IF 超凈工作臺(江蘇蘇凈集團安泰公司);Multiskan MK3 自動酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司);BX40 顯微鏡(Olympus 公司);FAC SCIalibur 流式細胞儀(美國BD 公司)。

2 實驗方法

2.1 合歡皮總皂苷樣品的制備

稱取合歡皮，加入60 倍70%乙醇，加熱回流提取2 次，每次2.5 h，過濾，合并濾液，得提取液;提取液減壓回收乙醇并冷凍干燥;取合歡皮提取物凍干粉經D101 大孔樹脂分離，依次用蒸餾水及30%、70%乙醇沖洗。收集70%乙醇洗脫餾分，減壓回收乙醇，冷凍干燥得合歡皮總皂苷粉末，并分析其干物質量及總皂苷含量。

2.2 人微血管內皮細胞形態的觀察及增殖的測定

按常規于37 ℃、5% CO2培養箱以10%的小牛血清傳代培養HMEC-1 細胞，試驗時將細胞以8 ×103個/孔接種于96 孔板，生長至對數期后同步化培養24 h。取合歡皮總皂苷凍干粉，以全培養基分別配制至終濃度為1.0、1.5、2.0 μg/mL 作為加樣組，分別作用細胞48、72 h，采用光學顯微鏡觀察細胞形態變化。藥物作用結束后，選用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，去上清，每孔加入100 g/L 三氯醋酸100 μL 固定，靜置5 min 后移到4℃再放置至40 min，傾掉固定液，用去離子水洗5遍，空氣干燥，每孔加入4 g/L SRB 100 μL 室溫放置30 min，用10 ml/L 醋酸液洗5 遍，加入150 μL 10 mmol/L Tris 堿液(pH 10.5)溶解，在540 nm 波長下用酶標儀測定光密度值OD。以陰性組(不加合歡皮總皂苷干預，顯色為正常細胞與試劑反應)和空白組(不加任何物質，顯色為試劑反應)為對照，按以下公式計算合歡皮總皂苷對HMEC-1 細胞生長的抑制率。

2.3 臺盼藍染色觀察人微血管內皮細胞膜通透性

取對數期細胞經同步化培養24 h，按“2.2”項所述步驟加入不同濃度的合歡皮總皂苷，繼續在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養48 h 或72 h，消化收集細胞(包括漂浮細胞)，1000 rpm 離心5 min，棄去培養基，PBS 重懸并調整細胞濃度至5 ×104個/mL。加入0.2%臺盼藍溶液，滴在載玻片上，以陰性組(不加合歡皮總皂苷干預)為對照進行觀察。

2.4 DNA Ladder 觀察人微血管內皮細胞凋亡

采用DNA 梯形條帶(DNA Ladder)法，對數期細胞經同步化培養24 h，按“2.3”項所述步驟收集不同濃度的合歡皮總皂苷作用后的細胞，按細胞全基因組DNA 提取試劑盒步驟說明，提取細胞全基因組的DNA，4 ℃冰箱備用。制備1.8%瓊脂糖凝膠，60 V 電泳1 h，用紫外投射儀觀察梯形條帶，并攝影，以陰性組(不加合歡皮總皂苷干預)為對照進行觀察。

2.5 流式細胞儀分析人微血管內皮細胞周期

取對數期細胞經同步化培養24 h，按“2.3”項所述步驟收集不同濃度的合歡皮總皂苷作用后的細胞，1000 rpm 離心5 min，棄去培養基，PBS 漂洗2次，在終濃度為70%的乙醇溶液中，冰上固定2 h，4℃冰箱保存備用。上機前離心除去固定液，PBS 漂洗，滴加新鮮配制的PI 染液，調至細胞濃度為1 ×104個/mL，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

3 實驗結果

3.1 合歡皮總皂苷對人微血管內皮細胞增殖的影響

所制合歡皮總皂苷粉末的干物質提取率為2.95%，總皂苷含量為63.18%。由圖1 可見，HMEC-1 細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴關系，其中作用48 h 時，合歡皮總皂苷對HMEC-1 細胞的抑制效果較好，其IC50為1.5 μg/mL。

圖1 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細胞增殖的影響Fig.1 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell proliferation

3.2 合歡皮總皂苷對人微血管內皮細胞形態的影響

通過光學顯微鏡可以發現，陰性組中細胞生長良好，細胞形態規則，加入合歡皮總皂苷干預后，隨著劑量的增加，細胞數量明顯減少，與陰性組形成顯著的差異，結果如圖2 所示。

圖2 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細胞形態的影響(100 ×)Fig.2 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell morphology (100 ×)

3.3 合歡皮總皂苷對人微血管內皮細胞膜通透性的影響

圖3 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細胞膜完整性的影響(臺盼藍染色，200 ×)Fig.3 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell membrane integrity (Trypan blue staining，200 ×)

臺盼藍染色表明，隨著合歡皮總皂苷劑量的增加，特別是高劑量組(2.0 μg/mL)有些細胞開始出現被染成藍色的現象，正常細胞和凋亡早期細胞排斥臺盼藍染料，凋亡晚期和壞死細胞由于細胞膜通透性變化，出現攝取染料變藍的現象，說明合歡皮總皂苷在高劑量下有可能改變細胞膜的通透性，引起細胞的凋亡壞死，結果如圖3 所示。

3.4 DNA Ladder 分析觀察人微血管內皮細胞凋亡的情況

電泳凝膠成像如圖4 顯示，合歡皮總皂苷作用48 h 后三個劑量組均出現凋亡梯形條帶現象，而在高劑量組(2.0 μg/mL)甚至出現了彌散現象，初步推斷高劑量的合歡皮總皂苷可能使細胞發生了壞死現象。

圖4 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細胞凋亡的影響Fig.4 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell apoptosis

3.5 合歡皮總皂苷對人微血管內皮細胞周期的影響

由表1 所示，合歡皮總皂苷各劑量組干預48 h和72 h 后，細胞被阻滯在亞G0/G1期，G0/G1期所占比例減少，且細胞周期變化呈藥物劑量和時間的依賴關系。

4 討論

內皮細胞的激活、增殖、遷移、基質降解及血管重構、血管和血管網形成等，在腫瘤新生血管生成過程中起著極重要的作用，其中最重要的是內皮細胞的增殖。已有文獻報道合歡皮粗提取物在動物體內明顯抑制腫瘤新生血管生成，從而抑制腫瘤生長、侵襲和遷移［3-9］。

本文證明合歡皮總皂苷可顯著抑制人微血管內皮細胞HMEC-1 的體外增殖，且與時間、劑量均存在依賴關系，作用48 h 后的IC50為1.5 μg/mL。高劑量組(2.0 μg/mL)作用時，光學顯微鏡發現細胞數量減少，臺盼藍染色發現其可能改變細胞膜的通透性，DNA 梯形條帶法發現其引起HMEC-1 細胞DNA彌散，提示出現細胞壞死現象。流式細胞儀PI 單染結果顯示，合歡皮總皂苷可使HMEC-1 細胞周期阻滯在亞G0/G1期。

表1 合歡皮總皂苷作用后HMEC-1 細胞周期分布Table 1 HMEC-1 cell cycle under A.julibrissin saponins intervention

綜上所述，合歡皮總皂苷提取物具有抑制血管內皮細胞增殖的作用，使細胞周期阻滯在亞G0/G1期，在高劑量作用下可能引起細胞產生壞死。

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