白蕓豆球蛋白的提取及其氨基酸組成研究

訾 艷，王常青，黨彥飛，陳 源，黃宜穎，李雯娟

山西大學生命科學學院，太原 030006

白蕓豆(white kidney bean)，生物學名菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)，別名四季豆、白腰豆等，在我國西南地區種植面積較大。白蕓豆中蛋白質含量19.9%～20.0%，脂肪含量1.6%～2.1%，碳水化合物含量37.6%～48.5%，并含有豐富的Ca、Fe、維生素C、維生素B1、維生素B2等維生素［1］;有研究表明，白蕓豆分離蛋白中必需氨基酸含量為41.34%，氨基酸評分為91.25［2］，由此可見，白蕓豆是一種營養價值較高的豆類食品。但是，目前未見有關白蕓豆中球蛋白的營養價值的研究報道。本課題研究表明，白蕓豆中含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中清蛋白含量最高(此文另發)。白蕓豆清蛋白中含有一種天然的α-淀粉酶抑制劑，可以用于治療肥胖癥和糖尿病等［3］。而提取清蛋白后所剩白蕓豆殘渣中含有大量球蛋白，為充分利用白蕓豆蛋白資源，本文研究了白蕓豆球蛋白的提取工藝，并對球蛋白的分子量和氨基酸組成進行了比較分析，旨在為白蕓豆蛋白資源的綜合利用提供理論依據。

1 材料與儀器

白蕓豆(購于云南銀健食品有限公司);白蕓豆分離蛋白(本實驗室采用堿溶酸沉法［4］制備);蛋白質電泳Marker(北京天恩澤基因科技有限公司);其他試劑(為國產分析純)。

DYCZ-23A 型電泳儀(北京市六一儀器廠);數顯恒溫水浴提取器(國華電器有限公司);UV-2600型紫外可見分光光度計［尤尼科(上海)儀器有限公司］;旋轉蒸發儀(上海申升科技有限公司);pH 計(奧立龍);Thermo MR23 冷凍離心機(美國熱電公司);日立835-50 型高速氨基酸分析儀(日本日立公司)。

2 試驗方法

2.1 白蕓豆球蛋白的提取試驗

白蕓豆烘干粉碎后過60 目篩，按1∶10 加入蒸餾水，在40 ℃提取2 次，每次2 h，提取后離心，棄去上清液，取沉淀干燥，作為球蛋白提取試驗的原料。球蛋白提取單因素試驗包括不同料液比(1 ∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、不同NaCl 濃度(0.5、1、2、3、4、5 g/100 mL)、不同溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)和不同時間(1、2、3、4、5、6h)的提取試驗。以上不同條件下的球蛋白提取液經4000 rpm離心20 min 取上清液，測定上清液中的蛋白含量，按下式計算球蛋白提取率:球蛋白提取率(%)=離心上清液中蛋白質含量×100/白蕓豆中總蛋白質含量;其中上清液中蛋白質含量用雙縮脲法［5］測定，白蕓豆中總蛋白質含量參照GB 5009.5-2010 測定。

在以上單因素試驗基礎上，選取工藝參數，進行球蛋白提取的正交試驗。

2.2 白蕓豆球蛋白的硫酸銨鹽析試驗［6］

取上一步中提取的球蛋白溶液8 等份，加入硫酸銨，分別達到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的飽和度，4 ℃靜置1 h，離心收集上清液，測定未沉淀蛋白含量，按下式計算球蛋白的鹽析得率:鹽析得率(%)=(球蛋白溶液中總蛋白質量-未沉淀蛋白質量)×100/球蛋白溶液中總蛋白質量。再取4 等份球蛋白溶液，按球蛋白鹽析得率最大的飽和度加入硫酸銨，在4 ℃下研究不同鹽析時間(0.5、1、1.5 和2 h)對球蛋白鹽析得率的影響。鹽析沉淀物透析48 h，冷凍干燥后得鹽析后的球蛋白。

2.3 白蕓豆球蛋白和分離蛋白的分子量測定

采用SDS-PAGE 凝膠電泳法確定白蕓豆球蛋白和分離蛋白的分子量。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%?？捡R斯亮藍R-250 染色。將蛋白質標準品的相對分子質量的對數對其相對遷移率作圖得標準曲線，根據回歸方程計算球蛋白和分離蛋白的相對分子質量。

2.4 白蕓豆球蛋白的氨基酸組成分析［7］

取樣品20 mg 加入6 mol/L HCl 沖入氮氣封口，在110 ℃烘箱內水解22 h，冷卻搖勻過濾，雙蒸水定容至50 mL，取1 mL 凍干后加入0.02 mol/LHCl 搖勻，14000 rpm 離心15 min，吸取上清液0.8 mL 過0.45 μm 濾膜，用日立835-50 氨基酸自動分析儀檢測。

3 結果與討論

3.1 白蕓豆球蛋白提取單因素試驗結果

3.1.1 NaCl 濃度對白蕓豆球蛋白提取率的影響

在料液比1∶10，40 ℃提取2 h 的條件下，NaCl濃度小于2 g/100 mL 時，白蕓豆球蛋白提取率隨著NaCl 濃度增加而顯著增大，在2 g/100 mL 時提取率達到最大值;之后隨著NaCl 濃度增加提取率呈下降趨勢(見圖1A)。這可能是因為當蛋白質溶液中有較多中性鹽時，會降低蛋白質極性基團與水分子之間的相互作用，使水化膜破壞;同時，蛋白質分子間的疏水性作用增加，導致蛋白質溶解度降低［8］。因此，正交試驗中NaCl 濃度選1.5、2 和2.5 g/100 mL。

3.1.2 料液比對白蕓豆球蛋白提取率的影響

以2 g/100 mL 的NaCl 溶液，在40 ℃提取2 h，料液比與球蛋白提取率的關系見圖1B。料液比1∶20 時，白蕓豆球蛋白提取率最大，高于和低于1∶20時，提取率均會下降。料液比降低不利于球蛋白的溶出，但過高的料液比可能增加原料中非蛋白物質的溶出。因此，正交試驗中料液比選在1∶18、1∶20和1∶22。

3.1.3 提取溫度對白蕓豆球蛋白提取率的影響

用2 g/100 mL 的NaCl 溶液，料液比1∶10，提取2 h，得到提取溫度與球蛋白提取率的關系(圖1C)。在60 ℃之前，提取率隨提取溫度的升高而增大，60℃時達到最大值;60 ℃之后，隨提取溫度的升高，球蛋白提取率迅速下降。有報道稱，蕓豆淀粉起糊溫度在70 ℃左右［9］，因此提取溫度高于70 ℃后，淀粉的糊化會阻礙蛋白質的溶出，從而降低了蛋白質的提取率。因此，下一步正交試驗中溫度選在55、60和65 ℃。

圖1 NaCl 濃度(A)、料液比(B)及提取溫度(C)對球蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of concentration of NaCI (A)，solid-liquid ratio (B)and extraction temperature (C)on extraction yield of globulin

3.2 白蕓豆球蛋白提取正交試驗結果

以NaCl 濃度、料液比和提取溫度的單因素試驗結果及提取時間的預實驗結果(提取5 h 時球蛋白提取率最高)為基礎，設計白蕓豆球蛋白提取的L9(34)正交試驗，結果見表1。

表1 白蕓豆球蛋白提取的正交試驗結果Table 1 Results of orthogonal experiment of extraction of white kidney bean globulin

表2 白蕓豆球蛋白提取的正交試驗方差分析表Table 2 Analysis of variance of extraction of white kidney bean globulin

正交試驗表明，白蕓豆球蛋白的最佳提取工藝參數組合為A3B3C1D2，即NaCl 濃度2.5 g/100 mL，料液比1∶22，提取溫度55 ℃，提取時間5 h。在此條件下進行驗證試驗，球蛋白提取率的平均值為31.46%，高于正交表中其他組合，證明正交試驗可靠。影響白蕓豆球蛋白提取率的因素為A ＞B ＞C＞D，即NaCl 濃度對球蛋白提取率的影響最大，料液比次之，提取時間的影響最小。方差分析也表明，NaCl 濃度對白蕓豆球蛋白提取率的影響極顯著(P＜0.01)，料液比影響顯著(P＜0.05)，而提取溫度和時間的影響不顯著。

圖2 白蕓豆球蛋白硫酸銨鹽析濃度曲線Fig.2 Ammonium sulphate salting-out curve of white kidney bean globulin

3.3 白蕓豆球蛋白的硫酸銨鹽析

由圖2 可知，隨著硫酸銨飽和度增加，球蛋白鹽析得率不斷增加，當硫酸銨飽和度為60%時，鹽析得率最大，再增大硫酸銨的飽和度，鹽析得率基本不變。在鹽析時間試驗中發現，在4 ℃時，用60%的硫酸銨鹽析球蛋白0.5、1、1.5 和2 h 的鹽析得率變化很小。最終選擇球蛋白鹽析的條件為:在4 ℃下，用60%的硫酸銨鹽析1 h，在此條件下，球蛋白鹽析得率的平均值為73.55%。

3.4 白蕓豆球蛋白和分離蛋白分子量的電泳分析

由白蕓豆球蛋白和分離蛋白的電泳圖譜可知，球蛋白共分離出6 條蛋白亞基條帶，分離蛋白共分離出8 條蛋白亞基條帶(這與張丙云［2］等人的研究結果一致)。將球蛋白和分離蛋白各亞基的相對遷移率帶入蛋白質Marker 標準曲線中，計算出球蛋白各亞基相對分子質量()由大到小分別為97.52 ±0.72、47.35 ±0.49、33.84 ±0.38、29.62 ±0.31、26.28 ±0.28 和21.99 ±0.19ku，分離蛋白各亞基相對分子質量分別為79.95 ±0.81、60.11 ±0.52、55.47 ±0.47、47.30 ±0.41、33.89 ±0.38、29.68 ±0.33、26.24 ±0.21 和21.97 ±0.16ku?？梢?，白蕓豆分離蛋白和球蛋白共有5 條蛋白亞基條帶相吻合，說明白蕓豆分離蛋白中的主要成分是球蛋白。

圖3 白蕓豆球蛋白和分離蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoretogram of white kidney bean globulin and isolated protein

3.5 白蕓豆球蛋白的氨基酸組成分析

由表3 可知，白蕓豆球蛋白中含有18 種氨基酸(色氨酸因樣品處理采用酸水解未檢出)，氨基酸總量達76.56%，其中谷氨酸和天冬氨酸含量最高，分別為11.51% 和9.59%，而蛋氨酸含量最低，為1.33%。球蛋白中人體必需的8 種氨基酸總量為30.91%，與總氨基酸的比值(EAA/TAA)為40.37%，這與FAO/WHO 提出的EAA/TAA 為40%左右的參考蛋白模式相近，說明球蛋白屬于優質蛋白。從表4 比較分析可知，白蕓豆分離蛋白的第一、第二限制性氨基酸分別為異亮氨酸和蘇氨酸，而球蛋白分別為蘇氨酸和異亮氨酸。球蛋白的AAS 為83.50，與標準模式接近。與其他植物蛋白不同的是，賴氨酸不是白蕓豆球蛋白的第一限制性氨基酸。此外，球蛋白中苯丙氨酸+酪氨酸含量遠高于FAO/WHO 模式推薦值?？梢姲资|豆球蛋白必需氨基酸比例均衡，營養價值較高。

表3 白蕓豆球蛋白氨基酸組成與含量(g/100 g)Table 3 Amino acid composition and content of white kidney bean globulin (g/100 g)

表4 白蕓豆球蛋白的必需氨基酸組成及氨基酸評分(g/100 g)Table 4 Essential amino acid composition and amino acid score of white kidney bean globulin (g/100 g)

4 結論

白蕓豆球蛋白最佳提取條件為NaCl 濃度2.5 g/100 mL，料液比1 ∶22(g/mL)，溫度55 ℃，時間5h，此時球蛋白提取率為31.46%。用60%的硫酸銨，在4 ℃下鹽析1 h，球蛋白的鹽析得率為73.55%。白蕓豆球蛋白電泳分離出的6個蛋白亞基條帶中，有5 條與分離蛋白的電泳條帶相同，分離蛋白中只有79.95、60.11 和55.47 ku 這3個亞基在球蛋白中沒有。白蕓豆球蛋白的氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸含量接近FAO/WHO 推薦模式，是較好的植物蛋白質資源。

1 Zhao R(趙蓉)，Li DW(李多偉)，Shen XD(沈曉東)，et al.Study on α–amylase inhibitor from white kidney beans.Chin Tradit Pat Med(中成藥)，2008，30:1355-1357.

2 Zhang BY(張丙云)，Yuan YL(袁亞蘭)，Gao YJ(高瑜璟)，et al.Study on nutritional assessment and functional properties of kidney bean protein.Sci Tech Food Ind(食品工業科技)，2010，31:347-350.

3 Zhao R(趙蓉).Purification and nature research on lose weight medicine α-amylase inhibitor from white kidney beans.Xi'an:Northwest University(西北大學)，MSc.2010.

4 Ren HW(任海偉)，Li ZZ(李志忠)，Wang MG(王鳴剛)，et al.Effect of ultrafiltration on antioxidant activity of kidney bean protein hydrolysates.Food Sci(食品科學)，2009，30:212-216.

5 Wang YH(王永華).Food Analysis(食品分析).Beijing:China Light Industry Press，2011.124-125.

6 Lin R(藺瑞)，Zhang ML(張美莉)，Zhang JC(張家超).Purification and antioxidant activity of globulins from naked oat seeds.Food Sci(食品科學)，2011，32:31-34.

7 Wang YL(王艷玲)，Zhang M(張敏).Extraction process and analysis amino acid composition of defatted rice bran albumin and globulin.Sci Tech Food Ind(食品工業科技)，2013，34:226-231.

8 Mo CW(莫重文).Protein Chemistry and Technology(蛋白質化學與工藝學).Beijing:Chemical Industry Press，2007.81-82.

9 Du SK(杜雙奎)，Wang H(王華)，Nie LJ(聶麗潔).Study on physical and chemical properties of kidney bean starch.J Chin Cereals Oils Assoc(中國糧油學報)，2012，27:31-35.