烏骨雞黑色素氧化降解工藝研究

黃宇玫，田穎剛，喬娟娟

1南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047;2 南昌大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330029

烏骨雞黑色素是一種大分子的生物功能活性物質(zhì)，具有抗氧化清除自由基［1］、延緩衰老［2］、抗誘變和提高機(jī)體免疫力［3］等功能，由于烏骨雞黑色素具有黑色素的共性特征，即不溶于水和幾乎所有溶劑且與蛋白質(zhì)緊密相連［4］，這對(duì)烏骨雞黑色素的深入研究造成極大的影響。目前國(guó)內(nèi)外大多對(duì)烏骨雞黑色素這一系多聚物進(jìn)行整體性研究，通過元素分析、ICP-AES 對(duì)其C、H、O、N、S 及金屬元素進(jìn)行分析，通過波譜法(紅外光譜、電子能譜、電子順磁共振波譜、X-射線衍生等)研究其基本結(jié)構(gòu)特征。但這些結(jié)構(gòu)特征及信息仍不能完全闡述烏骨雞黑色素的結(jié)構(gòu)。

近年來，研究者采用化學(xué)氧化降解法［5］、高溫裂解氣相質(zhì)譜法［6］對(duì)烏骨雞黑色素進(jìn)行裂解，并對(duì)裂解后物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究，期望對(duì)烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步闡明，其中化學(xué)氧化降解法包括高錳酸鉀氧化降解法、堿性過氧化氫氧化降解法。孫亞真等［7］對(duì)烏骨雞黑色素進(jìn)行化學(xué)氧化降解，并用HPLC 色譜對(duì)降解產(chǎn)物酸性乙醚萃取物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物中PDCA 和PTCA;涂勇剛等采用Py-GC/MS 對(duì)烏骨雞黑色素進(jìn)行高溫裂解分析發(fā)現(xiàn)裂解產(chǎn)物中存在苯、苯酚、吲哚、吡咯、氰類衍生物及脂類物質(zhì)。

烏骨雞黑色素作為一個(gè)大分子多聚物，實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過化學(xué)降解所得降解產(chǎn)物較復(fù)雜，且不同的降解方法對(duì)烏骨雞黑色素的降解程度及降解產(chǎn)物的種類是有影響的。本實(shí)驗(yàn)采用四種不同的氧化降解方法對(duì)烏骨雞黑色素進(jìn)行降解，并對(duì)降解得率、降解產(chǎn)物分子量進(jìn)行初步分析，運(yùn)用GC-MS對(duì)不同降解方法所得降解產(chǎn)物乙醚萃取部分進(jìn)行分析，為指示不同降解方法對(duì)烏骨雞黑色素降解程度及降解產(chǎn)物中物質(zhì)的種類的影響，也為進(jìn)一步研究烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)及彼此間生源關(guān)系提供一定的依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

烏骨雞黑色素由實(shí)驗(yàn)室自制。

硅膠G 板，青島海洋化工廠分廠;牛血清白蛋白，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞色素C、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸，購(gòu)于索萊寶公司;葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、濃硫酸、高錳酸鉀、亞硫酸鈉、碳酸鉀、過氧化氫(30%)、氫氧化鈉、氨水(25%)、乙醚、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、香草醛、硫酸、磷酸、氯化鐵、溴酚蘭、溴百里酚蘭、磷鉬酸、茚三酮、正丁醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛、丙酮、硅鎢酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HL-2S 恒流泵，上海青浦滬西儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;G1314B 型Agilent 紫外檢測(cè)器;G1310A 型Agilent 單元泵;Agilent 6890 型氣相色譜與5973 型質(zhì)譜聯(lián)用儀;ZF-2型三相紫外儀，上海安亭電子儀器廠;TGL-16G-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;Precisa XB220A 分析天平;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司;PHS-2C 型pH 計(jì)，上海理達(dá)儀器廠;UV-2000 紫外-可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司;DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 烏骨雞黑色素的不同方法降解

2.1.1 碳酸鉀-過氧化氫氧化法

［8］并做改進(jìn)，精密稱取100 mg 烏骨雞黑色素，加入100 mL 1 mol/L K2CO3，以一定流速連續(xù)通入4 mL 30% H2O2(可稀釋處理)，100 ℃加熱回流反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后流水冷卻，取1/4 反應(yīng)液離心(6000 rpm，5 min)，沉淀用蒸餾水洗滌兩次后，合并上清，上清與沉淀置于恒重后坩堝中，于105 ℃恒重，以計(jì)算降解得率。剩余反應(yīng)液用重蒸后乙醚進(jìn)行萃取，每次5 mL，萃取5 次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1 mL 用于GC-MS(降解產(chǎn)物中揮發(fā)性成分)分析;萃取后剩余液濃縮后定容到50 mL 以用于降解產(chǎn)物成分及分子量分析。樣品編號(hào)為A。

2.1.2 高錳酸鉀氧化法

參考文獻(xiàn)［9］并做改進(jìn)，精密稱取100 mg 烏骨雞黑色素，置于500 mL 圓底燒瓶中，加入200 mL 1 mol/L H2SO4，混勻后，加入3% KMnO4，每次200 μL，高速磁力攪拌反應(yīng)至紫色消失時(shí)，立即再次加入200 μL，直到紫色不消失，靜置10 min 后，加入10% Na2SO32 mL 除去剩余的KMnO4和MnO2。取1/4 反應(yīng)液離心(6000 rpm，5 min)用于得率分析，剩余反應(yīng)液用重蒸后乙醚進(jìn)行萃取，每次5 mL，萃取5次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1 mL 用于GC-MS(降解產(chǎn)物中揮發(fā)性成分)分析;萃取后剩余水相縮后定容到50 mL 用于降解產(chǎn)物成分及分子量分析，樣品編號(hào)為B。

2.1.3 氫氧化鈉-過氧化氫氧化法

精密稱取烏骨雞黑色素100 mg，置于50mL 反應(yīng)釜內(nèi)，加入pH 12 的NaOH 溶液20 mL，以0.2 mL/min 流速通入30%的H2O23.4 mL(可稀釋處理)，90 ℃保溫?cái)嚢枥淠磻?yīng)，反應(yīng)20 h，反應(yīng)結(jié)束后流水冷卻。降解液定重至40 g，取混勻的降解液10 g 用于得率分析，剩余反應(yīng)液用重蒸后乙醚進(jìn)行萃取，每次5 mL，萃取5 次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1mL 用于GC-MS(降解產(chǎn)物中揮發(fā)性成分)分析;萃取后剩余液濃縮后定容到50 mL 以用于降解產(chǎn)物成分及分子量分析，樣品編號(hào)為C。

2.1.4 氨水-過氧化氫氧化法

參考文獻(xiàn)［10］并做進(jìn)一步改進(jìn)，精密稱取100 mg烏骨雞黑色素，按固液比10∶3(W∶V)加入pH 值為10 的氨水溶液，勻速通入30%的H2O22.5 mL(可稀釋處理)，70 ℃水浴攪拌反應(yīng)8 h，流水冷卻后，定重，反應(yīng)液混勻后取1/4 用于得率分析，剩余反應(yīng)液用重蒸后乙醚進(jìn)行萃取，每次5 mL，萃取5 次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1 mL 用于GC-MS(降解產(chǎn)物中揮發(fā)性成分)分析;萃取后剩余液濃縮后定容到50 mL 以用于產(chǎn)物成分及分子量分析，樣品編號(hào)為D。

2.1.5 得率計(jì)算

2.2 烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物分子量分布測(cè)定

運(yùn)用凝膠色譜柱測(cè)定不同方法降解所得烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物的分子量分布，用已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品作分子量與時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線來衡量各降解產(chǎn)物的分子量分布情況，從而比較不同方法所獲降解產(chǎn)物分子量大小，為后期研究提供依據(jù)。前期研究發(fā)現(xiàn)烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物紫外全波長(zhǎng)掃描圖中最大吸收峰在205～215 nm 之前，故本實(shí)驗(yàn)吸光度測(cè)定選用210 nm。

2.2.1 色譜條件

2.2.1.1 分子量范圍100～7000 Da

儀器:Agilent131 型高效液相色譜儀;色譜柱:Superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm I.D.，13-15 μm);檢測(cè)器:Agilent G1314B 型紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;流動(dòng)相:0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，含0.01 mol/L 氯化鈉，pH 為6.96;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2.1.2 分子量范圍＞7000 Da

儀器:Waters515 二元高壓高效液相色譜儀;色譜柱:Ultrahydrogel Linea 7.8 ×300 mm column;檢測(cè)器:視差檢測(cè)器(RID-10A 型);流動(dòng)相:超純水;檢測(cè)溫度:35 ℃，柱溫箱:35 ℃;流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2.2 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分子量范圍100～7000 Da:將分子量標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相配制成0.5 mg/mL 的溶液，充分溶解混勻后用0.45 μm 水系膜過濾，按“2.2.1.1”色譜條件進(jìn)樣分析。分子量標(biāo)準(zhǔn)品分別為:細(xì)胞色素C、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽以及甘氨酸。

分子量＞7000 Da:將系列分子量標(biāo)品用超純水配制成2 mg/mL 的溶液，充分溶解后用0.45 μm 水系膜過濾，按“2.2.1.2”色譜條件進(jìn)行分析，葡聚糖標(biāo)品分別為:T-2000(2000000 Da)、T-70(7000 Da)、T-40(4000 Da)、T-10(10000 Da)和葡萄糖(180 Da)。

2.2.3 不同降解產(chǎn)物的分子量測(cè)定

將A、B、C 樣用流動(dòng)相配制成濃度為0.5 mg/mL 的溶液，0.45 μm 的水系微孔濾膜過濾，按“2.2.1.1”色譜條件進(jìn)樣分析;D 樣配制為用超純水4 mg/mL 溶液，按“2.2.1.2”色譜條件進(jìn)行分析。

2.3 四種不同降解產(chǎn)物乙醚萃取物GC-MS 初步分析

2.3.1 GC-MS 分析條件

色譜條件:Agilent HP-5 毛細(xì)管色譜柱(30 m ×250 μm，0.25 μm);自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，不分流模式，進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫:初始溫度60℃，保留3 min，以5 ℃/min 的速率升至300 ℃，保留15 min;檢測(cè)器溫度250 ℃;載氣He，流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:EI 電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;掃描周期2.84 次/s，掃描范圍33～500 u;數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)MSD Chem Station;標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫(kù):NIST02。

2.3.2 樣品分析

取“2.1”所制備乙醚萃取物過膜進(jìn)行GC-MS 分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 四種不同氧化降解方法對(duì)烏骨雞黑色素可溶性產(chǎn)物得率的影響

由圖1 可看出，在高錳酸鉀條件下，降解產(chǎn)物得率最高，達(dá)到82.5%;碳酸鉀-過氧化氫降解得率次之，為61.5%;氫氧化鈉-過氧化氫(pH 12)及氨水-過氧化氫(pH 10)得率分別為56%和53.6%，這表明在強(qiáng)堿及強(qiáng)氧化條件下，烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物得率較中低強(qiáng)度堿性條件下要高，推測(cè)可能由于強(qiáng)堿條件下黑色素舒展溶解性增強(qiáng)，更易被過氧化氫氧化斷裂所致。

圖1 不同降解方法所得可溶性產(chǎn)物得率Fig.1 Yields of soluble components of BSFM degradation products using different degradation methods

但由于強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件，降解產(chǎn)物中酸及鹽的含量較高，使后期水溶性降解產(chǎn)物的分離程序變復(fù)雜，且對(duì)水溶性降解產(chǎn)物分析也造成了較大的影響;與其相比，較弱的條件降解得率可達(dá)到50%以上，且雜質(zhì)含量少，分析水溶性產(chǎn)物較便利。

3.2 四種不同氧化降解方法對(duì)烏骨雞黑色素水溶性產(chǎn)物分子量的影響

3.2.1 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

3.2.1.1 分子量范圍100-7000 Da 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 為甘氨酸、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽和細(xì)胞色素C 在凝膠柱上的保留時(shí)間，根據(jù)此表得出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:logMw=-0.2272x +7.1626，R2=0.9957。

表1 分子量標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間min 及l(fā)ogMwTable 1 The retention times and logarithmic values of molecular weight markers

3.2.1.2 分子量＞7000 Da 標(biāo)準(zhǔn)曲線

運(yùn)用凝膠色譜測(cè)定物質(zhì)分子量的依據(jù)是凝膠的分子篩原理，即對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，其要求的分子量范圍內(nèi)，物質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)(LogMw)與其在凝膠柱上的洗脫體積(Ve)及分配系數(shù)(Kav)存在線性關(guān)系，根據(jù)關(guān)系式Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)，Ve=abLogMw(其中V0為藍(lán)色葡聚糖的洗脫體積，Vt 為葡萄糖的洗脫體積)計(jì)算出Ve 和Kav，以LogMw 為橫坐標(biāo)，Kav 為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Kav=-0.2383LogMw+1.5498，R2=0.9909。

表2 系列葡聚糖的保留體積Ve 和KavTable 2 The retention volume and Kav of Dextrans

對(duì)四種不同降解產(chǎn)物水溶性部分的分子量分布進(jìn)行初步測(cè)定，降解產(chǎn)物分子量分布不僅可以間接評(píng)估降解方法的劇烈程度，同時(shí)也對(duì)烏骨雞黑色素在不同方法下的降解程度進(jìn)行了指示。通過對(duì)降解程度不同的掌握，為降解產(chǎn)物進(jìn)一步的分析做了基礎(chǔ)鋪墊。水溶性產(chǎn)物分子量分布結(jié)果如圖2，烏骨雞黑色素各方法降解產(chǎn)物分子量如表3 所示。氨水-過氧化氫降解分子量最大，且分子量跨度也較大為一千到幾萬道爾頓，次之為碳酸鉀-過氧化氫降解，氫氧化鈉-過氧化氫與高錳酸鉀降解樣圖譜保留時(shí)間相當(dāng)，分子量相當(dāng)，均在1000 Da 以下，這表明不同降解方法對(duì)烏骨雞黑色素的降解程度不同，其中強(qiáng)酸性環(huán)境下高錳酸鉀氧化降解烏骨雞黑色素程度最大，而氨水-過氧化氫的降解程度最小，進(jìn)一步表明強(qiáng)酸、強(qiáng)堿介質(zhì)中黑色素更容易被氧化斷裂。

表3 烏骨雞黑色素各方法降解產(chǎn)物分子量Table 3 The molecular weight distribution of different degradation products

圖2 樣品A、B、C、D 的分子量分布圖Fig.2 The molecular weight distribution of sample A，B，C and D

3.3 GC-MS 分析不同降解產(chǎn)物的乙醚萃取部份的化學(xué)組成

烏骨雞黑色素的化學(xué)氧化降解過程亦是一個(gè)復(fù)雜的過程，且產(chǎn)物亦是復(fù)雜混合的未知物。采用GC-MS 對(duì)四種不同氧化降解方法獲得的降解產(chǎn)物乙醚萃取部分進(jìn)行物質(zhì)定性分析。圖3 為四種樣品總離子流圖，由圖可以看出A、B、C 樣乙醚萃取物中物質(zhì)含量較D 樣多，且A、B 樣物質(zhì)含量相當(dāng);從種類數(shù)來看，D 樣物質(zhì)種類數(shù)最少，其他三種樣品相當(dāng);從物質(zhì)成分來看，A 和B 樣中物質(zhì)主要以有機(jī)酸和脂類物質(zhì)為主，其中A 又以脂類為主，還含有少量萘、醛、酮、醇、菲、唑及胺類物質(zhì)，B 則以有機(jī)酸類物質(zhì)為主，含有少許烴類及吡喃、呋喃、吡唑衍生物，C 樣中主要成分為脂肪族與不飽和烴類、酮及醛類，還含有少量吡啶、呋喃、吖啶、少量有機(jī)酸及醚類物質(zhì);D 樣中成分為酚類衍生物、烴類、芴、酰胺以及喹啉衍生物。

四種不同氧化降解樣品乙醚萃取物中的物質(zhì)種類和含量有差異與降解條件有很大的關(guān)系，碳酸鉀降解提供了強(qiáng)堿性環(huán)境，為過氧化氫的氧化提供了一個(gè)有利的條件;盡管黑色素不溶于酸性介質(zhì)，但高錳酸鉀在強(qiáng)酸性條件下有極強(qiáng)的氧化能力，故在降解產(chǎn)物中存在許多被徹底氧化的有機(jī)酸類物質(zhì);氨水-過氧化氫由于對(duì)黑色素的斷裂程度最低，降解產(chǎn)物分子量較大，故其萃取物中的物質(zhì)種類及含量較少。

圖3 樣品A、B、C、D 乙醚萃取物GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of ethereal extracts of BSFM degradation products A，B，C and D

4 結(jié)論與討論

烏骨雞黑色素經(jīng)四種不同化學(xué)氧化降解方法降解后，降解產(chǎn)物中產(chǎn)物得率、分子量分布及乙醚萃取物存在的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:降解方法不同，降解產(chǎn)物各指標(biāo)也存在相應(yīng)差異。降解產(chǎn)物得率隨降解條件強(qiáng)度的增加而增大，強(qiáng)氧化條件下得率較中低強(qiáng)度堿性條件下要高，其中高錳酸鉀法最高為82.5%，碳酸鉀-過氧化氫次之為61.5%，其余均在50%以上;降解產(chǎn)物分子量以氨水-過氧化氫法最高，高達(dá)12265.5 Da，碳酸鉀-過氧化氫次之為1572.8 Da。

四種降解產(chǎn)物乙醚萃取物揮發(fā)性物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)氨水-過氧化氫降解產(chǎn)物中揮發(fā)性成分較少，可能與其降解產(chǎn)物程度較小產(chǎn)物、分子量較大有關(guān);其他方法所得產(chǎn)物中揮發(fā)性成分均較多，其中氫氧化鈉-過氧化氫降解物中以烴類物質(zhì)為主，也存在少量的酸類物質(zhì)，而碳酸鉀和高錳酸鉀降解產(chǎn)物中以脂肪酸和酯類物質(zhì)為主，含有少量烴類物質(zhì)。這表明降解方法的不同對(duì)影響到降解產(chǎn)物各方面的性質(zhì)差異。烏骨雞黑色素是大分子生物多聚物，其降解過程較復(fù)雜且存在各種不確定性，故控制好降解條件對(duì)其結(jié)構(gòu)成分的研究有一定的幫助，通過初步確定化合物種類亦可為后期相應(yīng)產(chǎn)物分離奠定基礎(chǔ)。

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