柴達(dá)木栽培和野生枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量的測定

曹靜亞，譚 亮，遲曉峰，胡風(fēng)祖*

1中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008

枸杞子(Fructus lycii)是茄科植物枸杞的成熟果實(shí)。枸杞子是名貴的藥材和滋補(bǔ)品，中醫(yī)很早就有“枸杞養(yǎng)生”的說法，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有重要的地位。《本草綱目》記載:“枸杞，補(bǔ)腎生精，養(yǎng)肝，明目，堅(jiān)精骨，去疲勞，易顏色，變白，明目安神，令人長壽”。枸杞子作為藥食兼用的名貴資源，已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。藥典中在評價枸杞子的內(nèi)在質(zhì)量時，選用了枸杞甜菜堿、多糖類成分為含量測定指標(biāo)［1］，東莨菪內(nèi)酯具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)心血管［2-4］等作用，是枸杞子中的重要活性成分之一。而根據(jù)已有文獻(xiàn)報導(dǎo)，對枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量測定的報道較少，對柴達(dá)木枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量測定的相關(guān)報道并未見。

青海柴達(dá)木地區(qū)獨(dú)特的高原大陸性氣候造就了柴達(dá)木枸杞子的優(yōu)良品質(zhì)。據(jù)記載，柴達(dá)木地區(qū)栽培枸杞子的年產(chǎn)量約為10～20 噸，野生枸杞子的年產(chǎn)量約為2～10 噸，是一筆寶貴的可利用資源。本文采用高效液相色譜法進(jìn)行了枸杞子中東莨菪內(nèi)酯的含量測定，并對其測定方法進(jìn)行考察，旨在為青海柴達(dá)木枸杞子的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及主要儀器

實(shí)驗(yàn)中所用的柴達(dá)木栽培和野生枸杞子樣品均采自青海省海西州各地區(qū)，經(jīng)中科院西北高原生物研究所胡風(fēng)祖研究員鑒定為枸杞子真品。

東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110768-200504)購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司);超純水(實(shí)驗(yàn)室自制，電阻率≥18.2 MΩ);其余試劑均為分析純。

Agilent 1100 高效液相色譜儀(配備有G1315型DAD 檢測器，美國安捷倫公司);AG135 電子天平(德國Mettler Toledo 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備

精密稱取東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品3.25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為130 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液。置于4 ℃冰箱中存放，備用。

1.2.2 樣品的處理

取本品粉末(粗粉)過4 號篩，精密稱定0.5 g，置于150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸溶液(4∶1，v/v)50 mL，于80 ℃水浴中回流提取1 h，取出，放冷。將提取液過濾到圓底燒瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)近干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL 容量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)液相進(jìn)行分析。

1.2.3 HPLC 分析

色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.05%磷酸溶液(35:65)，流速:1 mL/min，柱溫:30 ℃;檢測波長:344 nm;進(jìn)樣量:10 μL。HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 對照品(a)及樣品(b)的HPLC 圖(1:東莨菪內(nèi)酯)Fig.1 HPLC chromatogram of standard (a)and sample (b)(1:scopoletin)

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.2、1、2、4、6、8 mL 于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為2.6、13、26、52、78、104 μg/mL 的東莨菪內(nèi)酯對照品溶液。按上述色譜條件各進(jìn)樣10 μL，擬合峰面積(y)和進(jìn)樣量(x，μg)作回歸曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品溶液的制備方法優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)已有文獻(xiàn)報導(dǎo)，對枸杞子樣品中東莨菪內(nèi)酯測定試驗(yàn)中，多采用的是酸溶液回流水解，然后用氯仿多次提取的方法［5］。雖然該方法提取效率高，但考慮到氯仿的毒性大，成本高，操作繁瑣，本實(shí)驗(yàn)對該傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行了改進(jìn)。分別試用了(1∶4)鹽酸/甲醇溶液、(1∶6)鹽酸/甲醇溶液和甲醇為提取溶劑，對同一批枸杞子樣品進(jìn)行提取，結(jié)果(1∶4)鹽酸/甲醇溶液的提取率最高，并與酸水解氯仿多次提取的傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，提取效率一致。因此，選用(1∶4)鹽酸/甲醇溶液為提取溶劑，制備供試品溶液。

2.1.2 提取方式和時間的選擇

試驗(yàn)中，分別比較了超聲處理、浸泡和加熱回流三種常用提取方式，并比較了不同的提取時間對東莨菪內(nèi)酯提取率的影響，結(jié)果加熱回流處理1 h 的方法提取率最高，且方法簡單易行，因此，選擇該方法制備供試品溶液。

2.1.3 料液比的選擇

取同一樣品0.5 g(3 份)，分別精密加入(1∶4)鹽酸/甲醇溶液10、50、100、150 mL，加熱回流處理1 h，測定東莨菪內(nèi)酯含量，結(jié)果各處理測定含量基本一致，無顯著性差異，為保證有效成分的充分提取，選擇提取溶劑用量為50 mL。

2.2 色譜條件的優(yōu)選

2.2.1 流動相的選擇

易智彪等［5］在對枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量測定中，選用了甲醇-0.5%冰醋酸溶液為流動相，試驗(yàn)中，分別比較了甲醇-0.5% 冰醋酸溶液和甲醇-0.5%磷酸溶液，結(jié)果甲醇-0.5%磷酸溶液效果較好?？紤]到高濃度酸溶液對柱子的損耗大，實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇-0.5%磷酸溶液和甲醇-0.05%磷酸溶液，結(jié)果，在甲醇-0.05%磷酸溶液流動相條件下，樣品中的東莨菪內(nèi)酯峰形對稱，保留時間適宜，與雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離。因此，選擇甲醇-0.05%磷酸溶液的流動相條件。

2.2.2 檢測波長的選擇

分別吸取東莨菪內(nèi)酯對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，在200～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，東莨菪內(nèi)酯對照品溶液及供試品溶液主峰的光譜一致，均在344 nm 處有強(qiáng)紫外吸收，因此選定344 nm 為測定波長。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系

依據(jù)“1.2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，得東莨菪內(nèi)酯回歸方程y=0.863x +2.897，R2=0.9996，在0.026～1.040 μg 范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

2.3.2 重復(fù)性

取同一枸杞子樣品粉末6 份，精密稱定，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，測定峰面積并計算RSD，結(jié)果RSD 為2.4%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 精密度

精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積并計算RSD，結(jié)果RSD 為1.9%。表明該方法精密度較好。

2.3.4 穩(wěn)定性

取枸杞子供試品溶液一份，室溫放置，分別在0、2、4、8、12 和24 h 時進(jìn)樣10 μL，測定峰面積并計算RSD，結(jié)果RSD 為2.8%。結(jié)果表明東莨菪內(nèi)酯在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率

取已知含量的枸杞樣品(東莨菪內(nèi)酯的含量為212.72 μg/g)6 份，每份0.25 g。精密加入東莨菪內(nèi)酯對照品的甲醇溶液(130 μg/mL)0.4 mL，以下按“1.2.2”項(xiàng)下平行操作，制得加樣供試品溶液6份。吸取加樣供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測定東莨菪內(nèi)酯的含量，計算加樣回收率，結(jié)果回收率(n=6)為96.1%，RSD=2.0%。

2.4 樣品的測定及數(shù)據(jù)分析

22個柴達(dá)木栽培和野生枸杞子樣品均按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表1 和表2。

由以上兩表看出，柴達(dá)木地區(qū)栽培枸杞子中東莨菪內(nèi)酯平均含量(187.76 μg/g)低于野生枸杞子中(251.93 μg/g)。栽培枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量的波動遠(yuǎn)小于野生枸杞子，其原因可能是由于野生枸杞子本身的品種差異及生長環(huán)境的差異所造成。

表1 柴達(dá)木栽培枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量(n=3)Table 1 Contents of scopoletin in the cultivated FructusLycii from Qaidam Basin (n=3)

栽培枸杞子中，懷頭塔拉2 號樣地枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量最高(251.34 μg/g)，格爾木大格勒菊花村樣地枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量最低(131.17 μg/g);野生枸杞子中，尕海鎮(zhèn)陶哈村1 號樣地枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量最高(776.48 μg/g)，柯魯克湖南樣地枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量最低(53.42 μg/g);從枸杞子果實(shí)顏色上看，野生黑果和黃果枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量均較低，紅果枸杞子中含量普遍較高。

表2 柴達(dá)木野生枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量(n=3)Table 2 Contents of scopoletin in the wild FructusLycii from Qaidam Basin (n=3)

另外，根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，柴達(dá)木栽培和野生紅果枸杞子中東莨菪內(nèi)酯的平均含量，除了較寧夏中寧(編號為20050331-6)的低外，較其他地區(qū)(包括河北、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅)枸杞子中東莨菪內(nèi)酯的含量高。

綜上，柴達(dá)木栽培枸杞子具有很整齊的品質(zhì)優(yōu)良性，而野生枸杞子因其生長地區(qū)和自身品種不同，品質(zhì)差異很大，適宜于選擇性的開發(fā)。單從東莨菪內(nèi)酯含量考慮的話，柴達(dá)木栽培和野生紅果枸杞子適宜于作為原料藥材。

3 結(jié)論

依據(jù)已有文獻(xiàn)報道，本研究對枸杞子中東莨菪內(nèi)酯提取方法進(jìn)行優(yōu)化，采用甲醇-鹽酸溶液(4∶1，v/v)，水浴回流提取1 h，在保證了提取效率的前提下，避免了使用高毒、高成本的三氯甲烷溶劑，簡化了提取工藝，降低了提取成本。同時，本研究對東莨菪內(nèi)酯的測定方法進(jìn)行優(yōu)化，采用甲醇-0.05%磷酸溶液(35 ∶65)為流動相，流速:1 mL/min，柱溫:30℃，檢測波長:344 nm。在該條件下，樣品中的東莨菪內(nèi)酯峰形對稱，保留時間適宜，與雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離。對優(yōu)化的方法進(jìn)行了線性范圍、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度等相關(guān)方法學(xué)考察，結(jié)果表明，本文所建立的枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量測定方法準(zhǔn)確可靠，方法學(xué)考察結(jié)果符合有關(guān)規(guī)定，適用于枸杞子中東莨菪內(nèi)酯的含量測定。

通過對青海柴達(dá)木栽培和野生枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量的比較，發(fā)現(xiàn)栽培枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量整齊度遠(yuǎn)優(yōu)于野生枸杞子，紅果枸杞子中莨菪內(nèi)酯含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑果和黃果枸杞子;而不同地區(qū)、不同品種野生枸杞子中東莨菪內(nèi)酯含量差異很大。另外，單從東莨菪內(nèi)酯含量考慮的話，柴達(dá)木栽培和野生紅果枸杞子適宜于作為原料藥材。這一研究對于柴達(dá)木地區(qū)野生枸杞子的選擇性開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.VolⅠ，232.

2 Han F(韓楓).Pharmacological activity and pharmacokinetic study progress of scopoletin.Chin Pharm (中國藥房)，2011，22:2971-2972.

3 Pan R，Dai Y，Yang J，et al.Anti-angiogenic potential of scopoletin is associated with the inhibition of ERK1/2 activation.Drug Dev Res，2009，70:214-219.

4 Pan R，Gao XH，Xia YF，et al.Anti-arthritic effect of scopoletin，a coumarin compound occurring in ErycibeobtusifoliaBenth stems，is associated with decreased angiogenesis in synovium.Fundam Clin Pharmacol，2010，24:477-490.

5 Yi ZB(易智彪)，Zeng B(曾寶)，Lai XP(賴小平).Determination of scopoletin in Lyciumbarbarum L.by HPLC.Asia-PacTradit Med(亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥)，2010，6(4):13-15.