對葉百部化學成分液相行為研究

王 昶，陳麗艷，張樹明，魏文峰，王偉明

黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 150036

對葉百部(Stemona tuberosa Lour.Radix)為較常用中藥，主要用于治療咳嗽、殺蟲，中國藥典收載了直立百部［S.sessilifolia (Miq.)Miq.］、蔓生百部［S.japonica (Blume)Miq］.及對葉百部(S.tuberosa Lour.)［1］，其中對葉百部分布最廣，為臨床主要應用品種，同時，研究表明，其止咳效果優于另兩種百部［2］。中國藥典對百部的質量控制僅限于形態組織學研究，具有一定的局限性，故對百部，尤其是對葉百部進行深入研究十分必要，本文對對葉百部生物堿及非生物堿類成分進行液相行為的研究，以進一步推動百部質量標準的規范，并可為百部的相關基礎研究提供更多的實驗數據。

1 儀器與試藥

液相色譜:島津2010c 一體機，雙波長紫外檢測器，島津色譜工作站;電子天平:OHAUS 萬分之一電子天平，SATORIOUS 十萬分之一電子天平;酸度計:PHS-2，上海第二分析儀器廠。

百部藥材:采集自不同產地的對葉百部，具體見表1，經黑龍江省中醫研究院王偉明研究員鑒定為對葉百部;對照品:金剛大堿鹽酸鹽(croomine hydrochloride)、新對葉百部堿鹽酸鹽(neotuberostemonine hydrochloride)，實驗室自制。乙腈:色譜純，MERCK公司;液相用水:市售純凈水;其它溶劑均為分析純。

表1 對葉百部產地及采集時間Table 1 Origin and harvesting time of S.tuberosa sample

2 實驗方法

2.1 樣品溶液制備

取藥材粉末2.5 g，精密稱定，加甲醇100 mL，超聲提取兩次，每次40 min，過濾，殘渣加甲醇10 mL 分次洗滌，合并濾液和洗液，45 ℃減壓濃縮至干，殘渣加甲醇25 mL 溶解，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液配制

分別取金剛大堿鹽酸鹽及新對葉百部堿鹽酸鹽各5 mg，加甲醇配制成各含0.5 mg/mL 的對照品混合溶液，此兩種生物堿代表了對葉百部中生物堿的主要結構類型。

2.3 色譜條件

色譜柱:資生堂MGⅡ(4.6 mm × 250 mm，5 μm);檢測波長:210 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min。流動相:生物堿檢測為乙腈、0.02%氨水、水三相組成;非生物堿檢測為乙腈、0.01%磷酸、水三相組成，二者均采用pH 梯度洗脫。

圖1 不同流動相比例對對葉百部主要生物堿HPLC 行為的影響Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards of croomine hydrochloride and neotuberostemonine hydrochloride with different ratios of acetonitrile

3 實驗結果

3.1 對葉百部生物堿成分HPLC 測定及分析

3.1.1 流動相比例變化對對葉百部生物堿HPLC行

以金剛大堿鹽酸鹽及新對葉百部堿鹽酸鹽對照品混合溶液為樣品，按“2.3”項下HPLC 色譜條件進行檢測，流動相為乙腈:0.02%氨水，進樣量10 μL，分別調整氨水的比例依次為45%、50%、55%、60%，結果如圖1。

由圖1 可知，隨著氨水比例的增加，兩種生物堿色譜峰保留時間拖后，峰高降低、峰寬增加，但新對葉百部堿鹽酸鹽色譜峰(峰2)保留時間拖后要大于金剛大堿鹽酸鹽(峰1)，從圖譜觀察，流動相為乙腈:0.02%氨水(45∶55)時較為適宜。

3.1.2 流動相pH 值變化對對葉百部生物堿HPLC行為的影響

為考察pH 值變化對HPLC 行為的影響，分別調整流動相pH 值進行檢測，采用三元洗脫，固定乙腈比例為45%，依次調整0.02%氨水所占比例為1%、2%、3%、4%、5%、10%，其余為純水相，以金剛大堿鹽酸鹽及新對葉百部堿鹽酸鹽混合溶液進行檢測，結果見圖2。

圖2 不同pH 值流動相對百部生物堿色譜行為的影響Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standards of croomine hydrochloride and neotuberostemonine hydrochloride under mobile phases with different pH values

從圖可以看出，隨著氨水比例增加，二者色譜峰均呈現尖銳化特征，但金剛大堿鹽酸鹽峰形(峰1)在低堿度條件下明顯好于新對葉百部堿鹽酸鹽(峰2)，而隨著堿度的增加新對葉百部堿鹽酸鹽峰形有所改善，通過此現象可初步推斷，除與使用的色譜柱、柱溫的高低有關外，不同生物堿結構對pH 值反應存在較大差異，從而影響其HPLC 行為。但二者的保留時間并未隨pH 變化有明顯改變，此現象尚不能合理解釋。

3.1.3 不同產地對葉百部生物堿HPLC 圖譜分析

為比較不同產地對葉百部生物堿成分HPLC 行為差異，選取了5 種不同產地對葉百部進行檢測(見表1)，樣品處理按“2.1”項下方法，色譜條件根據以上實驗確定為乙腈:0.02%氨水(45∶55)，進行量10 μL，結果見圖3。

圖3 不同產地對葉百部生物堿HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of alkaloid components of S.tuberosa from different habitats

從圖中可看出，不同產地對葉百部生物堿成分HPLC 圖譜差異顯著，本文采用兩種結構的生物堿對照品進行標定，根據色譜峰出峰特點及流動相組成可初步判斷圖譜中的主要色譜峰為生物堿類成分，從圖中分析云南產對葉百部主含金剛大堿，而其它生物堿含量較少，而四川、廣西含有新對葉百部堿的同時，還含有較多的其它種類生物堿，這說明生長環境對生物堿的組成及含量有較大影響。

3.2 對葉百部非生物堿HPLC 測定及分析

3.2.1 流動相比例變化對對葉百部非生物堿成分HPLC 行為的影響

取云南產對葉百部，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，進行HPLC 檢測，流動相為乙腈-0.01%磷酸(m/v)-水，其三相的比例分別為10∶40∶50、20∶40∶40、30∶30∶40，結果見圖4。

圖4 不同流動相比例對對葉百部非生物堿HPLC 行為的影響Fig.4 HPLC chromatograms of non-alkaloid components of S.tuberosa under mobile phases with different ratios

從圖譜分析，流動相中乙腈所占比例對色譜峰保留時間影響較大，隨著乙腈比例增加色譜峰保留時間均有所提前，綜合峰形及保留時間考慮，流動相中乙腈比例為20%時較為適宜。

3.2.2 流動相pH 值變化對對葉百部非生物堿HPLC 行為的影響

取云南對葉百部，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，進行HPLC 檢測，流動相為乙腈-0.01%磷酸(m/v)-水，其中乙腈比例為20%，0.01%磷酸比例依次為10、20、25、28、29、30、40、60、80%，其余為水相，結果見圖5。

圖5 不同pH 值流動相對對葉百部非生物堿HPLC 行為的影響Fig.5 HPLC chromatograms of non-alkaloid components of S.tuberosa under mobile phases with different values

從圖中可看出，隨磷酸比例增加，色譜峰保留時間逐漸前移，峰寬變小，說明對葉百部中非堿性成分對pH 敏感度較高，隨pH 值減低，流動相洗脫能力增強，出峰提前。同時，可看出保留時間較長的色譜峰對pH 敏感度高于保留時間較短的色譜峰，這為pH 梯度洗脫HPLC 檢測提供了可能。

3.2.3 采用pH 梯度洗脫進行對葉百部非生物堿部位HPLC 檢測分析

根據上述實驗結果，通過梯度改變流動相pH值的方法進行對葉百部非生物堿成分HPLC 檢測。取5 種不同產地對葉百部，按“2.1”項下方法制備供試品，進行HPLC 檢測，流動相為乙腈-0.01%磷酸(m/v)-水，其中乙腈比例為20%，磷酸比例梯度為:0～8 min，10%;8～16 min，20%;16～24 min，30%;24～32 min，40%;32～40 min，10%。結果見圖6。

圖6 采用pH 梯度洗脫進行對葉百部非堿性部位HPLC分析圖譜Fig.6 pH gradient elution of non-alkaloid components of S.tuberosa from different habitats

從圖中可以看出采用pH 梯度洗脫進行百部非堿性部位的HPLC 檢測，各色譜峰分離度較好，保留時間多集中在5～25 min 以內，可用較短時間測定較多的色譜峰，并且圖譜基線較為平直。同時，從色譜圖比較分析，不同產地對葉百部非堿性部位的色譜峰相似度較高，各主峰基本可以一致，可用于指紋圖譜鑒別之用。

4 討論

百部生物堿具有吡咯氮雜環或吡啶氮雜環母核的獨特結構骨架，至今已從百部中分離得到100 余種生物堿，而對葉百部中主要含有對葉百部堿型及金剛大堿型生物堿［3，4］，實驗表明各產地對葉百部生物堿組成及含量差異大，不宜以此作為指紋圖譜研究對象用于對葉百部的鑒別及質量控制。但生物堿屬植物次生代謝產物，其含量及組成與土壤、氣候、光照等地理條件密切相關［5］，通過生物堿的組成與產地之間的相關性研究，可能為對葉百部產地鑒別提供了一種方法，同時生物堿作為百部主要藥效成分，也可作為評判藥材質量優劣的重要參考。

通過流動相中氨水比例對百部生物堿HPLC 行為的影響可初步分析，在堿性環境下，pH 值變化對色譜峰峰形有顯著影響，大堿度流動相中色譜峰峰形尖銳，而流動相堿度減低，峰形變差，同時，不同生物堿對環境pH 值反應存在較大差異，本實驗中新對葉百部堿的峰形變化較金剛大堿更加顯著。峰形變差可能是由于生物堿在色譜柱內洗脫過程中擴散所致，在高堿度流動相中，生物堿在固定相中更為集中，故出峰尖銳，而隨著堿度減低，生物堿在柱內擴散，峰形變差，而新對葉百部堿較金剛大堿在固定相的擴散程度更易受流動相pH 值影響，這可能與其分子結構、自身堿度及pH 值對分子電子分布的影響等因素有關，此尚待進一步研究。

據報道，百部中非堿性成分多為二苯乙烯類及其它酚酸性成分，這類成分已被證明有較好的藥理活性［6］。本實驗發現不同產地對葉百部的非堿性成分HPLC 圖譜相似度較高，這為進行對葉百部指紋圖譜研究提供了可能，但尚需進一步增加樣本量;本實驗中首次進行了pH 梯度洗脫HPLC 色譜法應用嘗試，采用流動相中有機相與水相組成比例不變，而僅改變流動相的pH 值的方式，利用待測成分對pH 變化的敏感性而進行分離，由于流動相中有機相及水相比例不發生變化，故基線不產生明顯漂移，而以往改變流動相組成的梯度洗脫方法往往存在顯著的基線漂移現象，應用此方法在發揮梯度洗脫優勢的同時，更便于色譜峰的比較和計算。在一些含有酸性或堿性成分的植物藥材中，如黃酮、蒽醌及有機酸等均對pH 值變化比較敏感，均可采用此方法鑒別，有較好的應用前景，因此在以后研究中將繼續完善并報導。

1 Zhang L(張雷)，Qiu QD(邱乾棟)，Zhang XL(張曉林)，et al.The research advancement on the genus stemona in China.Nor Hort(北方園藝)，2009，4:105-108.

2 Hu JP(胡君萍)，Zhang N(張囡)，Mao YQ(毛一卿)，et al.Antitussive activity comparison of three kinds of Stemonae Radix in Chinese pharmacopoeia.Chin J Chin Mat Med(中國中藥雜志)，2009，23:10-18.

3 Liu SW(劉世旺)，Fu HZ(付宏征)，Lin WH(林文翰).Alkaloids from the roots of Stemona tuberosa.Acta Pharm Sin(藥學學報)，1999，34:372-375.

4 Greger H.Structural relationships，distribution and biological activities of stemona alkaloids.Planta Med，2006，72:99-113.

5 Wang D(王丹)，Wang ZY(王振月)，Wang ZQ(王宗權)，et al.Brief on the progress of productive ways of the secondary metabolites in medicinal plants.Inf Tradit Chin Med(中醫藥信息)，2008，25:29-32.

6 Yang ZZ(楊新洲)，Lin LG(林理根)，Tang CP(唐春萍)，et al.Non-alkaloid constituents from Stemona sessilifolia.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2008，20:56-59.