骨髓活檢石蠟連片進行多種不同抗體免疫組化染色的應用

趙劍萍，黃曉赤，吳蓉宜，高冬明

(成都市第六人民醫院病理科，四川 成都610051)

骨髓活檢技術是淋巴造血組織和血液疾病診斷的常用技術，不僅能真實的展示各類細胞的分布情況和增生程度，還能觀察骨小梁、脂肪和結締組織之間的解剖關系［1］，被廣泛地應用于臨床。在具有完整的臨床資料、良好的組織學切片和輔以免疫組化標記的條件下，即使缺少分子遺傳學分析，大多數腫瘤可以確診。骨髓活檢組織受取材限制，組織較小，在做免疫組化染色時，如果采用將一張組織切片裱在一張防脫玻片上進行一種抗體的染色方法，一種疾病的診斷通常需要6 張或10 余張切片才能完成診斷所需免疫表型的染色。我科通過長期實踐，將骨髓活檢組織石蠟連片6 ～8 張共同裱在一張防脫玻片上同時進行6 ～8 種不同抗體的染色，既減少了防脫玻片的使用，縮短了制片時間，又方便醫生在診斷中可以對多種抗體的表達進行對比，利于診斷，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2006 年11 月至2013 年6 月送檢的所有骨髓活檢標本，共580 例。組織經固定、脫鈣后常規脫水、浸蠟、包埋。免疫組化試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化切片的制備 ①將包埋好的骨髓活檢組織3 μm 連續切片若干張(根據醫生選擇的抗體種類決定切片張數)。②取其中3 張蠟片各自貼附于一張防脫玻片上，分別用做HE 染色、網狀纖維染色(Gorden-sweet 法)、MPO 免疫組化染色(便于粒細胞計數)。③另取6 張或8 張蠟片分別在同一張防脫玻片一端的寬邊貼附2 張蠟片、長邊貼附3 張或4 張蠟片，蠟片組織之間的距離為0.5 ～1 cm，用做其他不同抗體的染色。④在貼附有石蠟連片的玻片磨砂端依次標明所要滴加抗體的名稱，一個組織對應一種抗體。⑤將準備好的切片置于60℃烤箱中烤片1 ～2 h。

1.2.2 免疫組化染色步驟 免疫組化染色采用二步法PV-9000 試劑盒。①切片脫蠟至水，蒸餾水洗。②高溫高壓隔水抗原熱修復，噴氣后計時5 min，停止加熱，待高壓鍋壓力恢復常壓后，打開鍋蓋取出燒杯，待修復液自然冷卻后將切片放入蒸餾水中洗。③取出切片，甩去切片上多余水分，滴加3%過氧化氫去離子水濕盒室溫孵育10 min。④蒸餾水洗，PBS(pH 7.4)沖洗，2 min×3 次。⑤甩去切片上多余水分后再用韌性好、吸水性強的紙擦干組織之間的水分(對組織進行封邊，避免抗體外溢，保證抗體濃度不被稀釋)，按照玻片磨砂端標明的不同抗體的名稱依次滴加相應的一抗，37 ℃濕盒孵育2 h或4 ℃過夜。⑥PBS(pH 7.4)沖洗，2 min×3 次。滴加試劑1(Polymer Helper)，37 ℃孵育30 min。⑦PBS(pH 7.4)沖洗，2 min×3 次。滴加試劑2(pohyper oxidase-anti-mouse/rabbit IgG)37 ℃孵育30 min。⑧PBS(pH 7.4)沖洗，2 min×3 次，DAB 顯色，鏡下控制顯色反應，蒸餾水沖洗，終止反應。⑨自來水充分沖洗，蘇木精復染，分化，返藍，脫水，透明，封片。

1.2.3 質量控制 在用吸水性強的紙進行組織封邊時要確保擦干組織之間的水分，這一步驟是保證抗體不外溢、一抗之間不發生交叉的關鍵;在每一批的免疫組化操作過程中設置陽性對照、陰性對照。

2 結果

MPO 在骨髓活檢病理診斷中是涉及粒細胞計數的一個重要指標，因此單獨用一張切片染色更能保證診斷的準確性(圖1);骨髓活檢組織石蠟連片在免疫組化染色后各組織之間界限清楚，多種抗體染色互不干擾，切片背景干凈、無非特異性著色，陽性定位準確(圖2、圖3)，便于閱片。

圖1 免疫組化染色MPO(PV-9000 法×10)

圖2 裱有多種標記的骨髓活檢石蠟連片的免疫組化切片

圖3 免疫組化染色FⅧ(PV-9000 法×10)

3 討論

采用骨髓活檢石蠟連片進行免疫組化染色，對疑為淋巴造血組織腫瘤的病例可以實現在一張玻片上完成所有T 細胞標記、B 細胞標記或T/B 細胞的標記等，使用3 張防脫玻片就可完成13 ～17 種抗體的標記，完全能滿足診斷需要;對于非腫瘤性疾病，只需2 張防脫玻片即可完成診斷所需的免疫組化染色(MPO，染色1 張，其余抗體的染色用貼附有石蠟連片的玻片1 張)。這種染色方法的優點是:①減少了防脫玻片的使用;②用紙吸水法替代其他封邊法進行組織封邊，簡單、方便、成本低廉，手工免疫組化染色尤為適用;③所用抗體均為病理科常用抗體，無需專門購買雙染試劑盒;④多張組織在同一張玻片上，實驗條件一致，減少了不同染色玻片人為造成的差異;⑤醫生可以在一張玻片上完成多種抗體染色結果的判讀。缺點是不能直觀地顯示兩種抗原在同一細胞或組織內的相互關系;不適用于免疫組化全自動染色儀。

要做好骨髓活檢組織石蠟連片的免疫組化染色，有幾點值得注意:①固定:良好的固定是制出優質切片的先決條件，用10%中性福爾馬林固定4 h以上就可以很好的保存抗原。②脫鈣:脫鈣良好才能切出完整的組織，采用Schriddle 氏脫鈣液［2］(甲醛10 ml、蒸餾水90 ml、硝酸20 ml)脫鈣2 ～3 h，既有固定作用又有脫鈣作用。在實際工作中，可以使用的脫鈣液種類很多，無論使用哪種脫鈣液，其目的是使脫鈣徹底，抗原保存良好。骨髓組織體積小，脫鈣時間不宜久，只要掌握好脫鈣時間，都能達到滿意效果。③漂片及烤片:設定常用漂片水溫為40 ℃，烤片溫度為60 ℃。各實驗室可根據工作經驗調整，建議溫度不能高，避免組織松散，抗原擴散、破壞。④免疫組化染色組織封邊:利用骨髓活檢組織石蠟連片做免疫組化染色，在滴加一抗前，一定要甩干切片上的多余水分后再用韌性好、吸水性強的紙擦干組織之間的水分，起到組織的封邊作用。只要做好這一步驟，就能避免在滴加一抗過程中出現抗體的外溢、融合，導致對染色結果的誤判。于蘭等［3］等運用唇膏封片法取得較好效果，但只能在短期起到阻水的效果，不能長久保留免疫組化液體不外溢;PAP 筆使用方便、效果穩定，但價格昂貴、消耗大;謝秋紅等［4，5］用指甲油封邊，購買方便、價格低廉，但在封邊時會有少許有害氣體揮發;徐明堂等［6］用自行設計的防溢液畫蠟筆進行封邊，有效避免了抗體液及其他染色的干擾，在使用過程中注意及時斷電，避免燙傷。

利用組織芯片技術做免疫組化染色，具有體積小、信息含量高的優點，并且可以根據不同的需要設計、組合出不同的受體蠟塊，主要適用于抗體測試、免疫組化染色的陽性/陰性對照［7］、室內質控［8］、DNA、RNA 原位雜交［9］，具有省時、經濟、信息量大等優點，但費用昂貴、構建組織微陣列相對復雜，難以普及推廣。近年來，部分醫院嘗試用免疫組化雙染技術在同一張組織切片上同時顯示兩種不同抗原的表達，取得滿意效果，其優點是可以明確兩種抗體在同一細胞或組織內的相互關系，缺點是若兩種抗原共存于同一細胞的胞質或胞核中，鏡下顯示的兩種染色顏色重疊，遇到這種情況就需要再分別做一下兩種抗體的染色［10］，使操作變得繁瑣、診斷報告延遲。

根據我院病例情況，在做免疫組化染色時選擇的常用抗體為:MPO、TdT、CD45、CD38、CD138、CD68、CD20、CD79а、CD3、CD45RO、CD61、CD117、CD34、Ⅷ因子、ki-67 及腫瘤相關抗原，這些常用抗體對確認骨髓中未成熟細胞群的譜系和腫瘤的分型有很大幫助［11］。我科在一張裱有骨髓活檢石蠟連片的玻片上同時進行多種不同抗體的染色，有效地診斷了淋巴造血組織疾病及腫瘤63 例，包括慢性粒細胞白血病15 例、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤6 例、多發性骨髓瘤7 例、急性淋巴細胞白血病3 例、淋巴瘤累及骨髓4 例、急性髓系白血病10 例、骨髓纖維化6 例、血小板增多癥1 例、再生障礙性貧血2 例、骨髓增生異常綜合癥9 例。

采用骨髓活檢石蠟連片進行多種免疫組化染色，操作方法簡單、效果穩定，具有可重復性。同樣的方法，還應用于內鏡組織、穿刺活檢組織，同樣能取得滿意效果。

［1］陳輝樹.骨髓病理學［M］.北京:人民軍醫出版社，2010:264.

［2］龔志錦，詹镕洲.病理組織制片和染色技術［M］.上海:上海科學技術出版社，1994:283.

［3］于蘭，何松，陳亞麗.介紹一種免疫組化封邊法［J］.臨床與實驗病理學雜志，2009，25(2):36.

［4］謝秋紅，孟奎，周曉軍.指甲油替代免疫組織化學PAP 筆的使用方法［J］.臨床與實驗病理學雜志，2002，18(2):184.

［5］蘇俊芳，鐘子鍵，何彥麗，等.多種封邊法在免疫組化染色中應用比較［J］.診斷病理學雜志，2007，14(5):365.

［6］徐明堂，杜傳國，呂翠環，等.防溢液畫蠟筆的制作和使用［J］.河北醫藥，2001，23(2):109.

［7］王翠芝，周小鴿，黃受芳，等.組織芯片在免疫組化染色陽性對照中的應用［J］.臨床與實驗病理學雜志，2006，22(4):481-483.

［8］趙麗平，蘇宏昌.“套餐式”組織芯片方法在免疫組化室內質控中的應用［J］.臨床與實驗病理學雜志，2012，28(1):106.

［9］孔廷誼，孔令非. 自制組織微陣列在自動免疫組化染色中應用［J］.臨床與實驗病理學雜志，2012，28(5):586.

［10］劉洪博，劉艷彩，張新麗，等. 免疫組化雙染技術在淋巴瘤亞型檢測中的應用［J］. 臨床與實驗病理學雜志，2012，28(10):1178.

［11］Juan Rosai. ROSAI＆ACKERMAN 外科病理學［M］. 回允中，主譯.北京:北京大學醫學出版社，2006:2050.