青蒿素固體脂質納米粒凍干劑的體外釋藥性質研究

朱九群，傅 川，何 林，曾明輝

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥學部，四川 成都610072;2.重慶醫科大學附屬永川醫院藥學部，重慶 永川402160;3.四川省邛崍市醫療中心醫院藥學部，四川 邛崍611350)

青蒿素(ART)是從菊科植物黃花蒿(artemisia annua L.)中提取得到的一種內含過氧化基團的倍半萜內酯化合物。近年來的相關研究已證實，青蒿素具抗腫瘤活性［1，2］，且治療濃度的青蒿素及其衍生物對正常細胞幾乎無作用。青蒿素為脂溶性藥物，傳統增溶方法并不能制成水溶液，不利于肺部給藥，且消除速率快，而固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)具有生物相容性好、毒性低、增溶、緩釋、被動靶向等特點，是一種較理想的載藥系統。我們在前期的研究中已建立了HPLC-MS 法測定大鼠血漿中青蒿素的濃度并將其用于肺部給藥后青蒿素濃度的測定［3］，本研究在成功制得青蒿素固體脂質納米粒的基礎上，考察青蒿素的緩釋作用，為青蒿素的進一步開發研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試藥:ART-SLN(實驗室自制);甲醇為色譜純;實驗用水為超純水，其余試劑均為分析純。主要儀器:Waters 600 Controller，Waters 717 plus Autosampler(美國)，SPD-10A UV 檢測器(島津，日本)，恒溫搖床(ZHWY-103B，上海智誠分析儀器制造有限公司)，透析袋(MW 1000)。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18 柱(0.5 μm，4.6×150 mm);流動相:0.05 M;磷酸鹽緩沖液(pH 5.8):甲醇(36 ∶64);檢測波長:260 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μl;流速:1 ml/min

1.2.2 ART 預處理方法 吸取樣品液100 μl 于10 ml 容量瓶內，加入900 μl 的乙醇混勻，再加入4 ml 0.2%的NaOH 溶液，搖勻，置50 ℃水浴反應30 min，冰水浴迅速冷卻至室溫，再加0.8 M 醋酸溶液定容，搖勻，放置30 min，取續濾液測定。

1.2.3 方法特異性 分別取ART 對照品溶液、空白釋藥介質和ART 對照品與空白釋藥介質的混合溶液按1.2.2 項下方法預處理，按1.2.1 項下色譜條件進樣分析。

1.2.4 標準曲線的建立 精密吸取儲備液(包封率測定法中的儲備液，濃度為1.532 mg/ml)適量，采用乙醇逐級稀釋制成濃度為100、80、40、20、10、5、2.5 μg/ml 的青蒿素標準溶液。按1.2.2 項下進行HPLC 測定，記錄青蒿素峰面積，以峰面積Y 對濃度X 做線性回歸。

1.2.5 回收率與精密度 分別精密吸取適量的ART 標準溶液于10 ml 容量瓶內，空白釋藥介質定容，混勻，制成濃度分別為5、20、80 μg/ml 的青蒿素乙醇溶液，按1.2.2 項下方法處理、測定，平行操作5 份，以實測值與加入值的比值計算回收率。于一天內連續測定5 次，計算日內精密度，連續測定3天，計算日間精密度。

1.2.6 ART-SLN 凍干劑體外釋藥試驗 分別取等體積、約等量的青蒿素乙醇溶液(ART-Sol)和ARTSLN 凍干復溶液于預處理的透析袋中，扎緊兩端，混懸于25 ml 釋放介質(含4%吐溫80 的NS 溶液)中，在(37±0.5)℃恒溫振蕩器上震蕩，轉速為100 r/min，定時吸取透析液0.2 ml，并補充等量新鮮釋放介質，進行3 次平行試驗。采用1.2.2 項下樣品處理法處理樣品，1.2.1 項下條件進行測定，計算不同時間點藥物的累計百分釋放量，繪制累積釋放曲線。

2 結果

2.1 方法特異性 由試驗所得到ART 的保留時間為3.07 min，且空白溶液不干擾測定，見色譜圖(圖1)。

圖1 ART 色譜圖

2.2 標準曲線 試驗所得回歸方程為Y=179X+19.3(r=0.9999)，表明在2.5 ～100 μg/ml 濃度范圍內，ART 色譜峰面積與其濃度有良好線性關系。

2.3 精密度與回收率 青蒿素高、中、低濃度回收率分別為102.65%、96.67%、103.92%。日內精密度分別為0.53%、1.19%和3.48%，日間精密度分別為1.39%、2.30% 和5.82%，見表1。表明該HPLC 法適用于本實驗釋藥介質中青蒿素含量的測定。

表1 精密度試驗驗結果 (n=5)

2.4 ART-SLN 凍干劑體外釋藥試驗結果 ARTSLN 凍干劑體外釋藥累積釋放曲線結果見圖2。分別以零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi 方程、R-P 方程和Weibull 方程對青蒿素溶液和納米粒體外釋藥數據進行處理，得到回歸方程，見表2。由表2 可見，ART 溶液和ART-SLN 膠體溶液的體外釋放模型，皆采用Weibull 方程擬合效果最佳。采用Weibull 方程計算ART 溶液的T50 和Td 分別為0.54 h 和1.05 h，ART-SLN 凍干劑的T50 和Td 分別為2.58 h 和3.68 h，分別是溶液組的4.81 和3.47 倍，可見，與ART 溶液相比，ART-SLN 具一定緩釋作用。

圖2 ART 溶液及ART-SLN 凍干劑釋放曲線

3 討論

3.1 體外釋藥方法的選擇 體外釋藥性質是評價納米粒載藥系統的一項重要指標。用于納米粒體外釋放研究的方法有動態透析法、水平擴散池法、反相滲析技術、超速離心法、離心超濾法等。本實驗采用應用最為廣泛的動態透析法考察ART-SLN 的釋藥性質。由于青蒿素幾乎不溶于水，因此選用乙醇溶液而不是水溶液進行溶解;同時，為滿足漏槽條件，及考慮青蒿素的含量測定方法，最終選擇含4%的吐溫80 的生理鹽水作為釋放介質。

3.2 青蒿素固體脂質納米粒體外釋藥行為 從ART-SLN 凍干劑的體外釋藥曲線可見，ART-SLN 釋放較快，2 h 內釋放量約為42%，這可能是由吸附或間插在納米粒表面的ART 解吸附引起的。ARTSLN 的突釋效應在體內試驗中，可發揮起效快的作用。采用不同的數學模型對體外釋放數據進行擬合，ART-SLN 和ART-Sol 的體外釋藥曲線采用Weibull 方程擬合較好。經計算，ART-SLN 凍干劑的T50 和Td 分別是ART-Sol 組的4.81 和3.47 倍，兩者具有統計學差異(P＜0.05)。可見，與ART 溶液相比，ART-SLN 具一定緩釋作用，達到預期目標。ART-SLN 的緩釋作用在體內試驗中能否延長ART的半衰期還有待進一步驗證。

表2 體外釋放擬合方程

［1］Klonis N，Crespo-Ortiz MP，Bottova I，et al. Artemisinin activity against Plasmodium falciparum requires hemoglobin uptake and digestion［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(28):11405-11410.

［2］Meunier B，Robert A.Heme as trigger and target for trioxane-containing antimalarial drugs［J］. Accounts of Chemical Research，2010，43(11):1444-1451.

［3］傅川，余繼英，鄒靜，等.HPLC-WS 法測定大鼠血漿中青蒿素濃度及其應用［J］.中國中藥雜志，2012，37(19):2964-29671.