快速溶劑萃取提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

曹靜亞，遲曉峰，陳 濤，董 琦，譚 亮，胡風(fēng)祖*

1中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008

何首烏為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根，其性微溫，味苦、甘、澀。何首烏在臨床應(yīng)用上有“生首烏”和“制首烏”之別，前者功能解毒、消癰、潤腸通便，后者補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨［1］。

何首烏主要含有蒽醌類、芪類和卵磷脂三大類成分，其中芪類化合物中的白藜蘆醇具有明顯的抗氧化、抗腫瘤生物活性［2，3］。白藜蘆醇在自然條件下以自由態(tài)和糖苷兩種形式存在。對白藜蘆醇苷的提取通常采用加熱回流的方法，張建超［4］等人對虎杖中白藜蘆醇苷的提取分離工藝進(jìn)行了研究，得到醇提工藝的最優(yōu)條件為:95%乙醇回流提取3 次，每次2 h。該種方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長。而白藜蘆醇具有熱敏性，回流提取時(shí)間長時(shí)，原料長時(shí)間受熱，在提取過程中易遭到破壞［5］。

ASE 是指在密閉容器內(nèi)于高溫(50～200 ℃)和高壓(500～3000 psi)條件下，在短時(shí)間內(nèi)，用有機(jī)溶劑提取固體或半固體樣品的一種新型樣品前處理方法［6］。與超聲、微波、回流、超臨界萃取等成熟方法相比，ASE 有有機(jī)溶劑用量少、提取時(shí)間短、萃取效率高、操作簡單方便、安全和自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)［7］。因此本研究選用快速溶劑萃取法(ASE)對何首烏中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷進(jìn)行提取，并采用響應(yīng)面分析法得到了ASE 提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷最優(yōu)的工藝參數(shù)，為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取開發(fā)利用提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)中栽培何首烏材料由青海西寧市廿里鋪蓓蕾花木有限公司提供，樣品經(jīng)陰干，粉碎后，過孔徑0.175 mm 篩，冷藏保存;白藜蘆醇(批號:111535-200502)購自中國藥品生物制品檢定所，白藜蘆醇苷(批號:H-012-110420)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;乙腈(色譜純)山東禹王;自制超純水;其余試劑均為分析純。

ASE350 快速溶劑萃取儀(美國DIONEX 公司);Agilent1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱Agilent Eclipse-XDB C18(5 μm，250 ×4.6 mm);MOLELEMENT 元素型超純水機(jī)(上海摩勒生物科技有限公司);METTLER TOLEDO PL203 和XS204 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC 檢測條件

色譜柱:Agilent Eclipse-XDB C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相∶V(乙腈)∶V(水)=23∶77;流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長306 nm。

1.2.2 不同提取方法的考察

1.2.2.1 超聲提取法

準(zhǔn)確稱取0.1 g 何首烏樣品，置于三角瓶中，精密加入50%的乙醇溶液25 mL，置于超聲波清洗器中提取一次，提取時(shí)間40 min，提取功率500 W。提取液過濾后，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)液相進(jìn)行分析。

1.2.2.2 加熱回流法

準(zhǔn)確稱取0.1 g 何首烏樣品，置于磨口三角瓶中，精密加入50%的乙醇溶液25 mL，稱重，于70 ℃下回流提取40 min，用提取溶劑補(bǔ)重。提取液過濾后，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)液相進(jìn)行分析。

1.2.2.3 ASE 法

準(zhǔn)確稱取0.2 g 何首烏樣品，置于34 mL 不銹鋼萃取池中，以50%的乙醇溶液為提取溶劑，提取一次，提取時(shí)間10 min，提取溫度70 ℃。用提取溶劑將提取液定容至100 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)液相進(jìn)行分析。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取對照品白藜蘆醇0.128 mg 和白藜蘆醇苷1.63 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用50%的乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。配置成濃度分別為12.8 μg/mL 和163 μg/mL 的對照品溶液。吸取以上對照品溶液1.00、2.00、6.00、8.00、10.00 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，擬合峰面積(y)和進(jìn)樣量(x，μg)作回歸曲線。

1.2.4 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率計(jì)算

按上述方法吸取10 μL 供試品溶液注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣三次，峰面積取平均值。將峰面積平均值代入回歸方程，即可求出供試品溶液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量C，帶入下式計(jì)算白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取率。

E(mg/g)=(C×V)/(I×W)

式中:C 為回歸方程求出的樣品溶液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量(μg);V 為定容體積(mL);I為進(jìn)樣量(μL);W 為樣品處理前干重(g)。

1.2.5 響應(yīng)面法提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期試驗(yàn)篩選，本實(shí)驗(yàn)主要考察乙醇濃度(%)、提取時(shí)間(min)和提取溫度(℃)3 個因素對響應(yīng)值白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率的影響，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Design-Expert 7.0.0 軟件，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的測定

按照“1.2.1”色譜條件，測得白藜蘆醇和白藜蘆醇苷對照品與何首烏樣品的液相色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(a)及樣品(b)的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of the mixed standards (a)and the sample (b)(1:polydatin;2:resveratrol);(1:白藜蘆醇苷;2:白藜蘆醇)

2.2 線性關(guān)系

依據(jù)“1.2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，得回歸方程:(1)白藜蘆醇Y=6284.61X-1.69，R2=0.9999，在0.0128～0.128 μg 范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系;(2)白藜蘆醇苷Y=3964.13X-8.57，R2=0.9999，在0.163～1.63 μg 范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

2.3 不同提取方法的比較

由實(shí)驗(yàn)得出，三種不同的提取方法得到白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總含量(n=5)分別為:超聲提取法(21.27 ±0.37)mg/g，加熱回流法(23.69 ±0.45)mg/g，ASE 法(25.43 ±0.41)mg/g。對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總含量的影響由高到低順序?yàn)?ASE ＞加熱回流法＞超聲提取法。其中，ASE 作為一種新的提取方法提取效果最好，提取時(shí)間少，而且不需要過濾步驟，避免了過濾過程中的損失。所以本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對ASE 提取何首烏中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 循環(huán)次數(shù)對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(乙醇濃度在50%，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間10 min)，考察循環(huán)次數(shù)分別為1、2、3 的條件下，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，在循環(huán)次數(shù)為1、2 次時(shí)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率幾乎不變，當(dāng)循環(huán)3 次時(shí)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率下降。因此，循環(huán)次數(shù)選為1 次。

2.4.2 乙醇濃度對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(提取溫度70 ℃，提取時(shí)間10 min，循環(huán)1 次)，考察乙醇濃度分別為0%、30%、50%、70%、100%的條件下，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，在乙醇濃度為0%～50%范圍內(nèi)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨乙醇濃度的升高而增加，但當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨乙醇濃度的升高而減小。因此，考慮到得率和成本，乙醇濃度選擇50%左右為宜。

2.4.3 提取溫度對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(乙醇濃度50%，提取時(shí)間10 min，循環(huán)1 次)，考察提取溫度分別為25、50、70、90、110 ℃的條件下白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，提取溫度對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率有很大的影響，在25～90 ℃范圍內(nèi)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨溫度的升高而增加，超過90 ℃后提取率幾乎不再增加，因此，提取溫度以90 ℃左右為宜。

2.4.4 提取時(shí)間對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響

保持其它條件不變(乙醇濃度50%，提取溫度90 ℃，循環(huán)1 次)，考察提取時(shí)間分別為1、5、15、25、35、45 min 條件下白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的變化。結(jié)果表明，在1～15 min 范圍內(nèi)白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率隨提取時(shí)間的升高而增加，超過15 min 后提取率隨提取時(shí)間而緩慢下降，可能是時(shí)間過長導(dǎo)致白藜蘆醇和白藜蘆醇苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，因此提取時(shí)間以15 min 左右為宜。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取工藝

2.5.1 模型方差分析

對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取工藝條件的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-expert 7.0.0 統(tǒng)計(jì)軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到多元二次回歸方程模型:

式中E 為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取率(mg/g);A 為乙醇濃度(%);B 為提取溫度(℃);C為提取時(shí)間(min)。

對該回歸方程進(jìn)行方差分析見表3，可以看出，回歸模型(P ＜0.0001)極顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，失擬項(xiàng)(P=0.9695 ＞0.05)，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著，因此，該模型對試驗(yàn)的擬合程度良好，能較好的反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該模型對實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行分析。由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個因素對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取得率影響的順序?yàn)樘崛囟?B)＞提取時(shí)間(C)＞乙醇濃度(A)。二次項(xiàng)A2、B2和C2影響極顯著，交互項(xiàng)AB、BC 達(dá)到極顯著水平，AC 顯著，表明各因素對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率的影響不是簡單線性關(guān)系。

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 ANOVA of regression analysis

2.5.2 響應(yīng)面分析

乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)3個因素之間的交互作用對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取得率的影響如圖2～4 所示。

圖2 E=f(A，B)的響應(yīng)面(a)及等高線圖(b)Fig.2 Response surface plot (a)and contour plot (b)of E=f (A，B)

圖3 E=f(A，C)的響應(yīng)面(a)及等高線圖(b)Fig.3 Response surface plot (a)and contour plot (b)of E=f (A，C)

圖4 E=f(B，C)的響應(yīng)面(a)及等高線圖(b)Fig.4 Response surface plot (a)and contour plot (b)of E=f (B，C)

分析圖2a～4a 可知，當(dāng)乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)取值較小時(shí)，效應(yīng)面曲線較陡，說明此時(shí)A、B、C 對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取得率影響較為顯著，但當(dāng)A、B、C 取值較大時(shí)，效應(yīng)面曲線較平緩，此時(shí)A、B、C 對E 影響較小。

分析圖2b～4b 可知，當(dāng)A、B、C 取值較小時(shí)，等高線密度大;當(dāng)A、B、C 取值較大時(shí)，等高線密度較小，說明A、B、C 取值小時(shí)，對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總提取得率影響較為顯著，與響應(yīng)面規(guī)律相同。同時(shí)，三個等高線圖均呈明顯的橢圓形，說明乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)三因素之間的交互作用均顯著，與方差分析結(jié)果一致。

經(jīng)過Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，得到最佳的提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度51%，提取溫度96℃，提取時(shí)間16 min，此時(shí)白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總提取率理論值可達(dá)到40.60 mg/g。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在此最佳工藝條件下，進(jìn)行3 次平行提取，測得白藜蘆醇和白藜蘆醇苷平均總提取率為40.43 mg/g。表明預(yù)測值與實(shí)際值之間具有很好的擬合性，從而進(jìn)一步證明響應(yīng)面結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)論

本研究采用3 種提取方法提取青海栽培何首烏中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，結(jié)果ASE 的提取效果最佳。利用響應(yīng)面法優(yōu)化了ASE 的提取工藝條件，優(yōu)化的最佳組合條件為:乙醇濃度51%，提取溫度96℃、提取時(shí)間16 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:響應(yīng)面模型擬合程度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取開發(fā)利用提供了技術(shù)支撐。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol Ⅰ，164.

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