蟲草發酵多糖的提取，結構分析及生物活性研究

付海田，鄧 超，王 敏，陳敬華

江南大學藥學院，無錫 214122

蟲草又稱冬蟲夏草，原為野生珍稀真菌，分布于我國青海、西藏、四川、甘肅、云南等地，在秘精益氣、止血化痰、滋補強壯等方面有獨特的療效［1］。蟲草潛在的生理活性與其多糖成分有著密切的關系。真菌多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血壓、降血脂等生理功效，并且對正常細胞不產生毒副作用［2］，因此可作為潛在的機體保健成分、免疫增強劑和抗衰老藥物加以開發。目前已有人工培植蟲草子實體，但因其生長環境極其嚴格復雜，難以模擬，而且栽培時間長，收獲量極少，因此不能被大規模的應用到醫用事業中。而采用人工發酵技術，很大程度上降低了成本投入，可獲得較多的成品，如菌絲體和發酵菌粉等。本文從蟲草發酵菌粉中通過熱水浸提法得到一種蟲草發酵多糖，測定了其分子量、糖苷鍵構型及單糖組成，并對該多糖的抗氧化和免疫增強活性進行了研究，為蟲草多糖的進一步開發利用提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蟲草發酵菌粉:由廣州無限極(中國)有限公司惠贈。小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7:由中國科學院細胞庫提供。試劑:DPPH、MTT、二甲亞砜、胰酶、LPS 購自于Sigma 公司;進口胎牛血清、DMEM高糖培養基購自于Gibco 公司;Griess 試劑盒與細胞因子試劑盒購自于英濰捷基(上海)貿易有限公司;Sephadex G-75 購自上海鵬順科學儀器有限公司;其余試劑均為國產分析純。

主要儀器設備:NICOLET NEXUS 470 紅外光譜儀、Multiskan Go 全波長讀數儀(賽默飛世爾儀器有限公司);LC 1200 凝膠滲透層析液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);GC-14A 氣相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取

將蟲草發酵菌粉置于索氏提取器內，依次用乙酸乙酯和無水乙醇冷凝回流脫脂6 h 后，殘渣用去離子水90 ℃下浸提24 h，離心后取上清液，無水乙醇沉淀(提取液∶乙醇=1∶4)獲得的粗多糖后，采用Sevag 法脫蛋白。將脫蛋白后的多糖溶液pH 調至8.0 左右，55 ℃下滴加30%過氧化氫，保溫2 h 至淡黃色后，透析去除鹽類等小分子物質［3］，獲得蟲草發酵多糖(CY)。

1.2.2 多糖的純度檢測

CY 用去離子水溶解至濃度為5 mg/mL，選取1 cm×30 cm 玻璃柱為層析柱，以Sephadex G-75 葡聚糖凝膠為固定相，0.1 mol/L 的NaCl 溶液為流動相，上樣量1 mL，全自動部分收集器控制流動相速度為6.7 min/管，1.5 mL/管，收集流出液。收集過程中以苯酚-硫酸法跟蹤監測收集液吸光值，結束后以收集管序號為橫坐標，收集管吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線。

1.2.3 總糖含量測定

采用苯酚硫酸法測定CY 中總糖含量，以葡萄糖做標準。

1.2.4 糖醛酸含量測定

采用咔唑硫酸法測定CY 的糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸做標準。

1.2.5 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定CY 的蛋白質含量，以牛血清蛋白做標準。

1.2.6 多糖分子量測定

用安捷倫LC1200 液相色譜儀對多糖分子量進行測定。

樣品處理:CY 用去離子水溶解至濃度為1 mg/mL 的多糖溶液，過0.45 μL 微孔濾膜后用凝膠滲透色譜法(GPC)測定多糖的重均分子量，以標準右旋糖酐做標準對照品。

液相條件:PL aquagel-OH 50 凝膠色譜柱(7.5 mm×300 mm，8 μm);示差檢測器(G1362A);柱溫:30 ℃;檢測器溫度:35 ℃;流動相:NaNO3溶液(0.1 mol/L);流速0.8 mL/min;進樣量10 μL。

1.2.7 單糖組成分析

用島津GC-14A 氣相色譜儀對多糖的單糖組成進行檢測分析。

樣品處理:將多糖用1 mol/L 的硫酸溶液100℃水解4 h 獲得游離單糖，水解液用碳酸鋇中和去除多余硫酸，濾液經冷凍干燥后既得游離單糖。上述干燥單糖樣品加入10 mg 鹽酸羥胺、0.5 mL 吡啶及2 mg 肌醇內標于90 ℃水浴中反應30 min 生成糖肟，冷卻后再加入0.5 mL 乙酸酐于90 ℃反應30 min 生成糖腈乙酸酯衍生物，待樣品冷卻后進行GC分析。以常見標準單糖做相同處理作為對照樣品。

氣相條件:OV1701 石英毛細管柱(30 m ×0.53 mm×1.0 μm);檢測器:氫火焰離子鑒定器(FID);氣化室溫度260 ℃;檢測器溫度250 ℃;柱溫升溫程序:起始溫度120 ℃，保持3 min，10 ℃/min 至195℃，保持0.1 min，3 ℃/min 至240 ℃，保持10 min;載氣壓力(N2):0.60 kg/cm2;燃氣壓力(H2):0.65 kg/cm2;助燃氣壓力(空氣):0.50 kg/cm2;分流比:30∶1;進樣量:2.0 μL。

1.2.8 紅外分析

采用紅外光譜法分析CY 的糖苷鍵構型。室溫條件下，將1 mg 干燥樣品與適量干燥溴化鉀混合研磨壓片后，在4000～400 cm-1范圍內進行掃描分析。

1.2.9 抗氧化活性研究

1.2.9.1 還原力測定

在具塞試管中加入1 mL 不同濃度的多糖溶液、0.2 mL 的PBS 溶液(2.0 mol/L，pH6.6)和0.25 mL的1%(w/v)的鐵氰化鉀溶液，置50 ℃恒溫水浴中反應20 min，迅速冷卻，再加入10%(w/v)三氯乙酸溶液0.5 mL，3000 g 離心10 min，取上清液1.5 mL，加入0.1mL1%(w/v)三氯化鐵溶液和3.0 mL 去離子水，振蕩均勻，靜置5 min，在700 nm 處以蒸餾水代替多糖溶液為空白測定吸光值［4］，每個試樣3 個平行樣，取平均值。以抗壞血酸做陽性對照。

1.2.9.2 對羥基自由基的清除

在試管中加入1 mL 不同濃度的多糖溶液，0.9 mL 硫酸亞鐵(0.15 mmol/L)，0.5 mL 水楊酸(9 mmol/L)，0.5 mL 雙氧水(8.8 mmol/L)，37 ℃反應60 min，于510 nm 處測定吸光值Ax，水楊酸替代雙氧水時的吸光值Ax0，水楊酸代替多糖測得空白對照吸光值A［5］0。以等濃度抗壞血酸代替樣品做陽性對照。對羥基自由基清除能力用下列公式:

1.2.9.3 對DPPH 自由基的清除

樣品管中加入1 mL 不同濃度的多糖溶液與3.0 mL 的0.004%(v/v)溶于95%乙醇的DPPH 溶液，室溫放置10 min 后，517 nm 處測定吸光值Ax，空白管用蒸餾水代替多糖溶液，測定值為A0，95%乙醇代替DPPH 測定值為Ax［6］0。對DPPH 自由基清除能力用下列公式:

1.2.10 體外免疫增強活性測定

細胞培養條件:RAW 264.7 細胞培養于DMEM培養基中，添加10%胎牛血清，培養條件為37 ℃，5% CO2，24 h 胰酶消化傳代。

1.2.10.1 細胞增殖實驗(MTT 法)

取對數期巨噬細胞用培養基調整細胞濃度為5×104/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔板，培養6 h，待細胞貼壁后棄上清，PBS 清洗除去未貼壁細胞后，樣品組分別加入100 μL 不同劑量(50、100、200 μg/mL)的藥物，空白對照組(Blank control，BC 組)加入等體積培養基，陽性對照組加入等體積LPS(10 μg/mL)。培養24 h 后，加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h 后棄上清，加入100 μLDMSO 室溫震蕩溶解結晶，570 nm 處測定吸光值。

1.2.10.2 對巨噬細胞NO 釋放量的影響

NO 在體內的半衰期極短，因此通過間接的測定NO 在體內水環境中氧化成NO-2 的含量來反映NO 的產生量。

取對數期巨噬細胞用培養基調整細胞濃度為7×105/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔板，待細胞貼壁后，棄上清，樣品組分別加入200 μL 不同劑量的藥物，空白組加入等體積培養基，陽性對照組加入等體積LPS(10 μg/mL)，繼續培養24 h 后，收集上清培養液，加入300 g/L 的ZnSO4溶液10 μL 震蕩去除蛋白，7000 rpm 離心10 min 后，吸取100 μL 上清液置酶標板中，加入等體積Griess 試劑，室溫震蕩反應10 min，以做同樣處理的培養基為調零組，讀取492nm 波長處吸光值，以標準曲線計算各組培養液中NO2-含量。

1.2.10.3 對巨噬細胞細胞因子釋放量的影響

采用酶聯免疫法，嚴格按照TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 試劑盒說明書進行操作。實驗樣品誘導培養條件同NO 釋放水平測定方法。

1.2.11 數據分析

實驗數據用SPSS 軟件進行單因素方差分析統計處理。

2 結果與分析

2.1 蟲草發酵多糖的提取及相關成分含量測定

CY 呈淡黃色絮狀，易溶于水，純度檢測結果見圖1，在收集管序號為56 管處出現一個單峰，該峰基本對稱，且無其它峰出現，表明該多糖純度較高。

圖1 CY 洗脫曲線Fig.1 Elution curve of CY

采用苯酚硫酸法測定多糖含量，回歸方程為:Y=0.00X-0.0116(R=0.9984，Y 為吸光度，X 為質量濃度)，計算可得CY 中總糖含量為90.53%。

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，回歸方程為:Y=4.6957X-0.002(R=0.9999，Y 為吸光度，X為質量濃度)，計算可得CY 中蛋白質含量為4.3%。

采用咔唑硫酸法測定糖醛酸含量，回歸方程為:Y=0.009X-0.0025(R=0.9997，Y 為吸光度，X 為質量濃度)，計算可得CY 中糖醛酸含量為12.42%。

由以上結果可知，所得CY 純度較高，多糖含量較高(＞90%)，蛋白質雜質含量較少(＜5%)，且糖醛酸含量較低，說明該多糖以中性多糖為主要成分。

2.2 多糖分子量

經GPC 檢測，CY 重均分子量為9.3 ×103g/mol。

2.3 單糖組成

標準單糖GC 色譜圖見圖2，CY 的GC 色譜圖見圖3，對比可知CY 由木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖四種單糖組成。根據內標法計算各單糖含量比例，由結果可知(見表1)其中甘露糖含量最高，木糖含量最少。

圖2 標準單糖GC 圖Fig.2 GC spectrum of monosaccharide standards

圖3 CY 的GC 圖譜Fig.3 GC spectrum of CY

表1 各多糖單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of polysaccharides

2.4 紅外分析

CY 的紅外光譜譜圖(見圖4)表現出一般多糖的特征吸收峰:由多糖羥基的伸縮振動引起的3600～3200 cm-1之間的吸收峰、由C-H 伸縮振動引起的2930 cm-1處的吸收峰等特征峰。此外在1100～1010 cm-1區域存在兩個D-呋喃糖苷的特征吸收峰;840 cm-1處無吸收峰，890 cm-1有明顯吸收峰，說明該多糖是以β 糖苷鍵相連的。

圖4 蟲草發酵多糖紅外色譜圖Fig.4 FTIR spectrum of CY

2.5 抗氧化活性

2.5.1 還原力測定

由圖5 可看出，隨著多糖濃度的增加，CY 的還原能力呈現出穩定的增長。質量濃度相同時，CY 的還原能力與抗壞血酸相比相差較大，說明其還原能力沒有抗壞血酸強。

圖5 還原力曲線Fig.5 Curve of reducing power

2.5.2 對羥基自由基清除能力測定

從圖6 中可看出，隨著質量濃度的增大，CY 對羥基自由基的清除能力也逐步增大，且在一定范圍內具有一定的量效關系。但與抗壞血酸相比，CY 對羥基的清除能力較低。

圖6 蟲草發酵多糖對羥自由基的清除能力Fig.6 Effect of CY on scavenging ?OH

2.5.3 對DPPH 自由基清除能力測定

由圖7 可看出，隨著多糖濃度的增加，CY 對DPPH 自由基的清除能力逐漸增強，且呈現出一定的劑量關系，但與抗壞血酸相比較，CY 對DPPH 自由基清除能力相對較低。

圖7 蟲草發酵多糖對DPPH 自由基的清除能力Fig.7 Effect of CY on scavenging DPPH·

2.6 免疫調節活性

2.6.1 細胞增殖實驗

CY 對RAW 264.7 細胞增殖的作用見圖8。與空白組相比，CY 濃度為50 μg/mL 時即可促進細胞的增殖(P ＜0.05)，且促進作用隨劑量的增加而增大，但較LPS 組的作用小。

圖8 RAW 264.7 增殖實驗結果Fig.8 Results of RAW 264.7 cell proliferation bioassay

2.6.2 對NO 釋放量的影響

NO 是一種具有廣泛生物功能的內源性可溶性氣體信號分子，有殺傷腫瘤細胞、抑制血小板凝集、舒張血管等重要生理功能。

CY 對巨噬細胞NO 分泌的影響見圖9，在CY低劑量(50 μg/mL)和中劑量(100 μg/mL)時，多糖對細胞NO 的分泌量無顯著影響(P ＞0.05)，在高劑量(200 μg/mL)時，可顯著促進NO 的分泌(P ＜0.01)。與LPS 組相比較，多糖對NO 分泌的促進作用較小。

圖9 CY 對巨噬細胞NO 釋放量的影響Fig.9 Effect of CY on NO secretion of mice macrophages

2.6.3 對細胞因子的影響

2.6.3.1 對TNF-α 分泌量的影響

TNF-α 在體內外對多種腫瘤細胞有著明顯的殺傷作用，還具有促進中性粒細胞吞噬、抗感染、促進細胞增殖分化等作用功能，在維持細胞內部自穩和抵御致病因子方面有重要作用。

由圖10 可知，低劑量時，CY 對TNF-α 分泌無明顯作用(P ＞0.05)，在中劑量和高劑量時，可顯著促進TNF-α 的分泌(P ＜0.01)，且在高劑量時，對TNF-α 分泌的促進作用顯著高于LPS 陽性對照組(P ＜0.05)。

圖10 CY 對巨噬細胞TNF-α 釋放量的影響Fig.10 Effect of CY on TNF-α secretion of mice macrophages

2.6.3.2 對IL-1 分泌量的影響

IL-1 在免疫反應中具有活化淋巴細胞、協同刺激胸腺細胞增殖和促進炎癥反應的功能，并促進B淋巴細胞分泌抗體和IL-2、增強NK 細胞的殺傷功能［7］。

由圖11 可知，低劑量時，CY 對IL-1 分泌無明顯作用(P ＞0.05)，在中劑量和高劑量時，可顯著促進IL-1 的分泌(P ＜0.05)，且在高劑量時，對IL-1分泌的促進作用與LPS 陽性對照組無明顯差異(P＞0.05)。

圖11 CY 對巨噬細胞IL-1 釋放量的影響Fig.11 Effect of CY on IL-1 secretion of mice macrophages

2.6.3.3 對IL-6 分泌量的影響

IL-6 主要作用是誘導B 細胞增殖分化，促進B細胞分泌抗體，且能夠提高LAK 和GTL 對腫瘤細胞的殺傷能力［8］。

低劑量和中劑量時(圖12)，CY 對IL-6 分泌無明顯作用(P ＞0.05)，高劑量時，可顯著促進IL-6 的分泌(P ＜0.01)，且促進作用與LPS 陽性對照組無明顯差異(P ＞0.05)。

圖12 CY 對巨噬細胞IL-6 釋放量的影響Fig.12 Effect of CY on IL-6 secretion of mice macrophages

2.6.3.4 對IL-12 分泌量的影響

IL-12 參與早期的非特異性免疫和進一步的特異性免疫中，在腫瘤、感染、自身免疫性疾病中起重要作用。

低劑量和中劑量時(圖13)，CY 對IL-12 分泌無明顯作用(P ＞0.05)，高劑量時，可顯著促進IL-6的分泌(P ＜0.05)，且促進作用與LPS 陽性對照組無明顯差異(P ＞0.05)。

圖13 CY 對巨噬細胞IL-12 釋放量的影響Fig.13 Effect of CY on IL-12 secretion of mice macrophages

3 結論

本文從蟲草發酵菌粉中提取得到的水溶性蟲草發酵多糖CY 主要成分為中性糖，分子量為9.3 ×103g/mol，主鏈由β 糖苷鍵連接，單糖組成為木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。體外試驗結果顯示，CY有較強的還原力，對羥基自由基和DPPH 自由基有一定的清除作用，即CY 有一定的抗氧化活性;此外CY 能夠促進巨噬細胞RAW 264.7 的增殖，并可促進NO 和細胞因子的分泌，表明CY 具有調節免疫的活性。發酵多糖的原料發酵菌粉來源豐富，價格低廉，具有抗氧化活性和免疫調節功能的蟲草發酵多糖為進一步應用于功能性食品和醫藥領域提供了一定的參考依據。

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